Regulation of anesthetic efficacy through GABA-A R phosphorilation

通过 GABA-A R 磷酸化调节麻醉效果

基本信息

批准号：
21K08941
负责人：
上野伸哉
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

前年度に確立したNeuro2Aの安定発現細胞株を用いて、パッチクランプ条件下にてGABAによる電流応答および麻酔薬の修飾効果を解析した。安定発現細胞株はbeta３サブユニットのS408/9部分をアラニン置換したS408/9A mutantとグルタミン酸に置換したS408/9E mutantの2種類を作成した。前者は脱リン酸化、後者はリン酸化に相当する変異導入となる。これらbeta3サブユニットと、alpha１とgamma2サブユニットを共発現させ解析した。　すべて野生型であるalpha1, beta3およびgamma2サブユニットを共発現させた細胞株の反応をコントロールとして比較検討した。beta３（S408/9A ）mutant サブユニットを含むGABA-A受容体はGABA投与に反応し、抗不安薬diazepamや麻酔薬propofol存在下でGABA応答は増強した。対照的にbeta３（S408/9E）mutantサブユニットを含むGABA-A受容体は応答が減弱した。免疫組織学解析によりbeta３（S408/9A ）mutant サブユニットを含むGABA-A受容体はコントロールと同様形質膜に分布しているが、beta３（S408/9E）mutantサブユニットを含むGABA-A受容体は形質膜へ分布していないことが明らかとなり、電気生理学的結果を支持するものであった。これらのことよりbeta3サブユニットのS408/9部位リン酸化が受容体トラフィッキングを制御していることが示唆された。さらにトラッフィキング関連のタンパク質探索のため、HEK293細胞にbeta３の野生型S408/9、S408/9A mutantおよびS408/9E mutantをそれぞれ発現させ、HA-tagを利用し免疫沈降をおこなった。コントロールには見られない特異的バンドを切り出して質量分析を行い、相互作用するタンパク質を同定した。

利用前一年建立的稳定表达Neuro2A的细胞系，我们分析了膜片钳条件下GABA诱导的电流反应和麻醉剂的修饰效果。创建了两种类型的稳定表达细胞系：S408/9A突变体，其中β3亚基的S408/9部分被丙氨酸取代，以及S408/9E突变体，其中β3亚基的S408/9部分被取代与谷氨酸。前者是去磷酸化，后者是磷酸化对应的突变引入。对这些 beta3 亚基以及 alpha1 和 gamma2 亚基进行共表达和分析。将共表达 alpha1、beta3 和 gamma2 亚基（所有这些亚基均为野生型）的细胞系的反应作为对照进行比较。含有β3(S408/9A)突变亚基的GABA-A受体对GABA给药有反应，并且在抗焦虑药物地西泮和麻醉剂异丙酚存在下GABA反应增强。相反，含有 beta3 (S408/9E) 突变亚基的 GABA-A 受体表现出减弱的反应。免疫组织学分析显示，含有β3（S408/9A）突变亚基的GABA-A受体分布在质膜上，与对照相似；显示该分子没有分布到质膜上，支持了电生理学结果。这些结果表明，β3 亚基 S408/9 位点的磷酸化控制着受体运输。此外，为了寻找与运输相关的蛋白质，我们在HEK293细胞中表达β3野生型S408/9、S408/9A突变体和S408/9E突变体，并使用HA标签进行免疫沉淀。切除对照中未见的特定条带并进行质谱分析以鉴定相互作用的蛋白质。

项目成果

期刊论文数量（9）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Intraperitoneal Administration of Etizolam Improves Locomotor Function in Mice After Spinal Cord Injury.

腹腔注射依替唑仑可改善脊髓损伤后小鼠的运动功能。

DOI：
10.1089/neur.2022.0071
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kenya Saruta; Tatsuhiro Fukutoku; Gentaro Kumagai; Toshihide Nagaoki Manami Tsukuda; Yohshiro Nitobe; Kanichiro Wada; Toru Asari; Taku Fujita; Isamu Sasaki; Yoshikazu Nikaido; Shuji Shimoyama ; Shinya Ueno; Yasuyuki Ishibashi
通讯作者：
Yasuyuki Ishibashi

Lipopolysaccharide induces mouse translocator protein (18 kDa) expression via the AP-1 complex in the microglial cell line, BV-2

DOI：
10.1371/journal.pone.0222861
发表时间：
2019-09-19
期刊：
PLoS ONE
影响因子：
3.7
作者：
Shuji Shimoyama;T. Furukawa;Yoshiki Ogata;Y. Nikaido;K. Koga;Yui Sakamoto;S. Ueno;Kazuhiko Nakamura
通讯作者：
Kazuhiko Nakamura

GABAA受容体の細胞内分布におけるβ3サブユニットのリン酸化の影響

β3亚基磷酸化对GABAA受体亚细胞分布的影响

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
藤井萌加;下山修司;古川智範;上野伸哉
通讯作者：
上野伸哉

Impaired Cognitive Function and Hippocampal Changes Following Chronic Diazepam Treatment in Middle-Aged Mice

中年小鼠长期地西泮治疗后认知功能受损和海马变化

DOI：
10.3389/fnagi.2021.777404
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
4.8
作者：
Furukawa Tomonori;Nikaido Yoshikazu;Shimoyama Shuji;Masuyama Nozomu;Notoya Ayaka;Ueno Shinya
通讯作者：
Ueno Shinya

beta3 サブユニットのリン酸化がGABAA受容体の機能および輸送へ及ぼす影響

β3 亚基磷酸化对 GABAA 受体功能和转运的影响