Analysis of mitochondrial iron accumulation mechanism on sideroblastic anemia model cells

铁粒幼细胞贫血模型细胞线粒体铁积累机制分析

基本信息

批准号：
21K08375
负责人：
金子桐子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Iwate Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08375/
关键词：
ヘム合成鉄代謝

项目摘要

1. 培養条件の再検討：本研究に用いているHUDEP細胞は樹立の報告にも記載されているが，分化誘導日数が長くなるほど細胞生存率が低下する。鉄の蓄積が顕微鏡下で検出できる条件では細胞生存率は20%前後であり，分化誘導による細胞生存率の低下はこれまでも懸念であった。近年，我々と異なる培養条件を用いているいくつかの報告があることから，それらを参考に分化条件の検討を行なった。その結果，細胞生存率およびRNA qualityが大きく改善され，生存率はHUDEP2では20%前後から60%程度へ上昇した。分化条件の変更に伴い，これまでに行なったタンパク質およびmRNA発現について再検討を行なったところ，これまで検討を行なったいくつかの因子mRNA発現について分化誘導による野生型と変異細胞株における差異を見出した。引き続き確認実験を行っている。また，2,3についても条件変更後に行った研究実績である。2. ALAS2変異細胞におけるferroptosisの検討：ferroptosisのマーカーであるGPX4タンパク質およびGPX, PGTS2 mRNAの発現についてそれぞれ検討を行なった。その結果，GPX4の発現は分化誘導前後にかかわらず野生型と変異細胞株では変化がなかった。一方，PTGS2 mRNA発現は分化誘導が進むと変異細胞のみにおいてその発現に変化が見られた。GPX4はこれまでに赤芽球の脱核に関与する報告があることから，発現が相殺されて変化が見えづらい可能性も考えられる。3. ALAS2変異細胞における網羅的解析：鉄蓄積機構の解明を目的に，ALAS2変異細胞と野生型細胞をについて分化誘導条件下で発現変化の網羅的解析を質量分析を用いて行う予定であったが，予算内でRNA-seq解析が行え，さらに学内の専門家の協力を得られる機会を得たため解析手法をRNA-seqに変更した。本検討には昨年樹立したSLC25A38変異細胞も加えており，遺伝性鉄芽球性貧血の異なる原因遺伝子についても比較検討を行なった。現在，結果を解析中である。

1.培养条件的复查：本研究使用的HUDEP细胞在建立报告中有描述，但分化诱导的天数越长，细胞存活率越低。在显微镜下可以检测到铁积累的条件下，细胞存活率约为20%，并且有人担心由于诱导分化而导致细胞存活率下降。近年来，有一些使用与我们不同的培养条件的报道，因此我们以这些作为参考来研究分化条件。结果，细胞存活率和RNA质量大大提高，HUDEP2的存活率从20%左右上升到60%左右。通过改变分化条件，我们重新检查了迄今为止研究的蛋白质和mRNA表达，发现野生型和突变细胞系之间由于分化而导致迄今为止研究的几个因子的mRNA表达存在差异感应。我们正在继续进行确认实验。另外，第2项和第3项也是改变条件后进行的研究结果。 2.ALAS2突变细胞中铁死亡的检查：我们检查了GPX4蛋白和GPX、PGTS2 mRNA的表达，它们是铁死亡的标志物。结果，在诱导分化之前和之后，野生型和突变细胞系之间GPX4的表达没有变化。另一方面，随着分化诱导的进行，PTGS2 mRNA 表达仅在突变细胞中发生变化。由于有报道称GPX4参与有核红细胞的去核，因此有可能表达被抵消并且变化很难看到。 3. ALAS2突变细胞的综合分析：为了阐明铁积累机制，我们计划使用质谱法对ALAS2突变细胞和野生型细胞在分化诱导条件下的表达变化进行综合分析，但是我们改变了分析。因为我们能够在预算范围内进行RNA-seq分析，并且有机会获得我们大学内专家的合作。这项研究包括去年建立的SLC25A38突变细胞，还对遗传性铁粒幼细胞贫血的不同致病基因进行了比较研究。目前正在分析结果。