腎臓オルガノイドを用いた腎線維化増悪因子の探索

使用肾脏类器官寻找肾纤维化加剧因素

• 批准号: 21K08223
• 负责人: 須佐 紘一郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08223/
• 关键词: 腎臓オルガノイド; 修飾遺伝子; 慢性腎臓病; 線維化

慢性腎臓病(CKD)では原疾患によらず線維化が進行するが、その機序は未解明な点が多い。腎線維化を生じる遺伝性疾患では、同じ遺伝子変異を有していても重症度の個人差が大きいことから、線維化の重症度に強い影響を与える別の修飾遺伝子の存在が疑われる。本研究では、腎臓オルガノイドを用いた網羅的なforward geneticsによって、このような腎線維化修飾遺伝子の同定を目指している。まず、目的の修飾遺伝子を探索するためのスクリーニング系の構築を行っている。線維化領域を可視化するためのfibronectin/α-SMA/COL1Aプロモーターで蛍光発色するレポーターを作製した。これらは一旦作製したものの、性能が不十分であることが判明し、再作製に取り組んでいる。また、修飾遺伝子はそれ単独で線維化を起こすわけではないため、何らかの因子により容易に線維化を起こすような背景を持つ「易線維化腎臓オルガノイドモデル」が必要となる。この易線維化腎臓オルガノイドモデルとして、CRISPR-Cas9システムによりNPHP1欠損iPS細胞の作製を行った(In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 2022)。また、別の易線維化モデルとして、各種線維化誘発サイトカインにより健常者由来腎臓オルガノイドを線維化させるモデルも作製した。現在、次の段階として、これらの腎臓オルガノイドを用いて線維化の修飾遺伝子をスクリーニングするための条件検討を開始している。スクリーニングに使用するFACSや、レンチウイルス型gRNAライブラリの感染効率等の条件検討を進め、候補遺伝子の絞り込みを目指す。

在慢性肾脏病（CKD）中，无论基础疾病如何，纤维化都会进展，但其机制仍然很大程度上未知。在导致肾纤维化的遗传性疾病中，即使具有相同的基因突变，个体之间的严重程度差异也很大，因此怀疑还有另一个修饰基因强烈影响纤维化的严重程度。在这项研究中，我们的目标是通过使用肾脏类器官的综合正向遗传学来鉴定此类肾纤维化修饰基因。首先，我们正在构建一个筛选系统来寻找目标修饰基因。我们使用纤连蛋白/α-SMA/COL1A 启动子创建了荧光报告基因来可视化纤维化区域。虽然它们曾经被创建过，但人们发现它们的性能不足，并且正在努力重新创建它们。此外，由于基因修饰本身不会引起纤维化，因此需要一个具有因某些因素而容易引起纤维化的背景的“易纤维化的肾脏类器官模型”。作为这种纤维化肾类器官模型，我们使用 CRISPR-Cas9 系统生成了 NPHP1 缺陷的 iPS 细胞（体外细胞和发育生物学 - 动物，2022）。此外，作为另一种易发生纤维化的模型，我们创建了一个模型，其中来自健康个体的肾脏类器官使用各种诱导纤维化的细胞因子发生纤维化。目前，下一步，我们开始研究使用这些肾脏类器官筛选纤维化修饰基因的条件。我们的目标是通过检查用于筛选的 FACS 和慢病毒 gRNA 文库的感染效率等条件来缩小候选基因的范围。

项目成果

Absence of ULK1 decreases AMPK activity in the kidney, leading to chronic kidney disease progression

ULK1 缺失会降低肾脏中的 AMPK 活性，导致慢性肾病进展

• DOI: 10.1111/gtc.12989
• 发表时间: 2023
• 影响因子: 2.1
• 作者: Tomoki Yanagi; Hiroaki Kikuchi; Koichiro Susa; Naohiro Takahashi; Naohiro Takahashi; Hiroki Bamba; Takefumi Suzuki; Yuta Nakano; Tamami Fujiki; Yutaro Mori; Fumiaki Ando; Shintaro M;ai; Takayasu Mori; Koh Takeuchi; Shinya Honda; Satoru Torii; Shigeomi S
• 通讯作者: Shigeomi S

ULK1-Regulated AMP Sensing Mechanism by AMPK Is Disrupted in CKD

AMPK 调节 ULK1 的 AMP 传感机制在 CKD 中被破坏

• 发表时间: 2022
• 作者: Tomoki Yanagi; Hiroaki Kikuchi; Koh Takeuchi; Koichiro Susa; Naohiro Takahashi; Yuta Nakano; Fumiaki Ando; Shintaro M;ai; Takayasu Mori; Shinya Honda; Satoru Torii; Shigeomi Shimizu; Tatemitsu Rai; Shinichi Uchida; Eisei Sohara
• 通讯作者: Eisei Sohara

ULK1-Regulated AMP Sensing Mechanism by AMPK Is Disrupted in CKD

AMPK 调节 ULK1 的 AMP 传感机制在 CKD 中被破坏

• 发表时间: 2022
• 作者: Tomoki Yanagi; Hiroaki Kikuchi; Koh Takeuchi; Koichiro Susa; Naohiro Takahashi; Yuta Nakano; Fumiaki Ando; Shintaro M;ai; Takayasu Mori; Shinya Honda; Satoru Torii; Shigeomi Shimizu; Tatemitsu Rai; Shinichi Uchida; Eisei Sohara
• 通讯作者: Eisei Sohara

Generation of NPHP1 knockout human pluripotent stem cells by a practical biallelic gene deletion strategy using CRISPR/Cas9 and ssODN

使用 CRISPR/Cas9 和 ssODN 通过实用双等位基因删除策略生成 NPHP1 敲除人类多能干细胞

• DOI: 10.1007/s11626-022-00655-0
• 发表时间: 2022
• 作者: Nakano Yuta;Susa Koichiro;Yanagi Tomoki;Hiraoka Yuichi;Suzuki Takefumi;Mori Takayasu;Ando Fumiaki;M;ai Shintaro;Fujiki Tamami;Rai Tatemitsu;Uchida Shinichi;Sohara Eisei
• 通讯作者: Sohara Eisei

Generation of NPHP1 knockout human pluripotent stem cells by a practical biallelic gene deletion strategy using CRISPR/Cas9 and ssODN

使用 CRISPR/Cas9 和 ssODN 通过实用双等位基因删除策略生成 NPHP1 敲除人类多能干细胞

• DOI: 10.1007/s11626-022-00655-0
• 发表时间: 2022-02-01
• 期刊: In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal
• 作者: Y. Nakano;K. Susa;Tomoki Yanagi;Y. Hiraoka;Takefumi Suzuki;Takayasu Mori;Fumiaki Ando;Shintaro M;ai;ai;Tamami Fujiki;T. Rai;S. Uchida;E. Sohara
• 通讯作者: E. Sohara