New innovation of jaw bone reconstruction using octacalciumphosphate/collagen composite and iPS cells

使用磷酸八钙/胶原复合物和 iPS 细胞重建颌骨的新创新

• 批准号: 20K09988
• 负责人: 高橋 哲
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K09988/
• 关键词: リン酸オクタカルシウム; iPS細胞; 骨再生医療; コラーゲン; 顎骨再建; 人工骨; リン酸オクタカルシウム; iPS細胞; 骨再生医療; コラーゲン; 顎骨再建; 人工骨

研究成果：iPS細胞を培養するためSNLフィーダー細胞を培養し、細胞がコンフルエントになった段階で，DNA合成/細胞分裂を阻害するためマイトマイシンC処理し細胞を播種した．翌日iPS細胞を播種し，約１週間後にコロニーが大きく形成された段階で浮遊培養することで胚葉体を形成した．胚葉体が十分形成されたのを確認後播種したiPS細胞の胚葉体をαMEM培地からなる骨分化用培地を作成し，骨芽細胞様細胞に分化させた。①OCP存在下、②コントロール (人工骨材料無し)で7, 14日間培養しアリザリンレッド染色，コンフォッサ染色を行い，骨芽細胞の分化、石灰化能を確認した．①, ②いずれにおいても骨芽細胞様細胞の分化を認め、OCP存在下での培養条件でより多くの分化による石灰化を認めた。より生体に近い環境での分化を再現するためiPS細胞を骨芽細胞様細胞に分化させた後、酸素透過性有機材料を用いた三次元スフェロイド培養を行った。培養条件は①OCP 存在下、②β-TCP存在下、③ハイドロキシアパタイト存在下、④コントロール(人工骨材料無し)とした。また，酸素透過性の有無による違いを確認するために，酸素不透過型の３次元スフェロイド培養器を作成し，iPS細胞単体での培養を行った．培養7日目の時点でOCP存在下での培養条件で最も大きいサイズのスフェロイドが形成された。酸素不透過型ではかなり小さいサイズのスフェロイドが形成されたがDNA量、ALP量を計測たが有意差は認められなかった。進捗状況OCP存在下にiPS細胞に由来する骨芽細胞様細胞の培養条件で細胞スフェロイドを形成することができ、より多くの細胞形成が確認できた。今後は上述の条件でReal-Time PCRを行いRunx2, Osterix, Osteocalcin, Osteopontinなどの骨芽細胞分化に寄与するタンパクの解析を行う予定である。

研究结果：培养SNL馈物细胞以培养IPS细胞，当细胞汇合时，将丝裂霉素C用丝裂霉素C处理，以抑制DNA合成/细胞分裂，并播种细胞。第二天，IPS细胞被播种，大约一周后，菌落在浮动培养中形成，从而形成了细菌体。在确认生殖体有足够的形成后，准备了种子IPS细胞的生殖体，以创建由αmem培养基制成的骨分化培养基，并分化为成骨细胞样细胞。 1）在OCP存在的情况下，2）在对照中（无人造骨料）7至14天，将细胞培养7至14天，并用艾他林红色和认可染色染色，以确认成骨细胞的分化和钙化。在①和②中，分化成骨细胞样细胞，并且在OCP存在下在培养条件下观察到更多的分化引起的钙化。为了重现在更接近活生物体的环境中的分化，IPS细胞被分化为成骨细胞样细胞，然后使用可氧气可渗透的有机材料进行三维球体培养。培养条件为1）在OCP存在的情况下，2）在存在β-TCP的情况下，3）在羟基磷灰石存在下，4）在对照中（没有人造骨材料）。此外，为了确认氧渗透性与是否存在氧气渗透性之间的差异，创建了可耐氧的3D球体孵化器并单独使用IPS细胞培养。在培养的第7天，在OCP存在下，在培养条件下形成了最大的球体。氧不透明类型形成了相当小的球体，但是测量了DNA和ALP量，但没有观察到显着差异。进展：在OCP存在下衍生自IPS细胞的成骨细胞样细胞的培养条件下形成了细胞球体，并确认了更多的细胞形成。将来，我们将在上述条件下进行实时PCR，以分析有助于成骨细胞分化的蛋白质，例如Runx2，Osterix，Ostecalcalcin和Osteopontin。