ガウシアルシフェラーゼを用いたインスリン分泌解析の新展開

高斯荧光素酶胰岛素分泌分析的新进展

基本信息

批准号：
20K09886
负责人：
鈴木崇弘
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Aichi Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまでに、ヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase, GLase）の融合タンパク質（Insulin-GLase）をレポーターとして利用し、独自開発の「分泌タンパク質の生物発光イメージング法」で、グルコース応答性の周期性インスリン分泌動態を可視化している。本手法を用いて、膵島と同様に、細胞塊（スフェロイド）で周期性インスリン分泌を示すInsulin-GLase定常発現ラット膵β細胞株であるiGL細胞を樹立している。今回、8倍希釈したマトリゲルでコーティングしたガラスボトムディッシュを用いた生物発光イメージング解析により、iGL細胞は膵島から単離したラット初代培養β細胞と同様の周期性でインスリン分泌を行うことを示した。ヒトで高頻度に利用されるコドンのみを使用した最適化遺伝子（pGLuc）を用いた効率の良いInsulin-GLase発現系の構築では、pGLuc遺伝子を利用したInsulin-GLase定常発現膵β細胞の作出し、周期性インスリン分泌のイメージングに取り組み、グルコース応答性インスリン分泌量変化の高いクローンを得ることはできた一方で、周期性インスリン分泌の点では、iGL細胞の方が初代培養細胞に近い応答性を示した。また、GLase融合タンパク質を用いた生物発光イメージング法を適用し、インスリン分泌促進に関わるオステオカルシンの骨芽細胞からの分泌動態を可視化した。局所で骨形成を促進するBMP2と比較して、血中でホルモン様に作用することが知られているオステオカルシンは開口分泌部位から速やかに拡散することを示した。なお、BMP2が開口分泌部位から徐々に拡散するためには、N末端に存在するヘパラン硫酸結合部位（塩基性アミノ酸配列）が必要であることを示した。

到目前为止，我们已经使用人胰岛素和高斯荧光素酶 (GLase) 的融合蛋白 (胰岛素-GLase) 作为报告基因，使用专有的“分泌蛋白生物发光成像方法”来研究葡萄糖反应性。可视化周期性胰岛素分泌动态。使用这种方法，我们建立了 iGL 细胞，这是一种大鼠胰腺 β 细胞系，它持续表达胰岛素-GLase，并在类似于胰岛的细胞簇（球体）中表现出周期性胰岛素分泌。在这里，使用涂有 8 倍稀释基质胶的玻璃底培养皿进行生物发光成像分析，我们发现 iGL 细胞分泌胰岛素的周期性与从胰岛分离的原代培养大鼠 β 细胞相似。为了使用仅使用人类常用密码子的优化基因 (pGLuc) 构建高效的胰岛素-GLase 表达系统，我们需要使用 pGLuc 基因创建持续表达胰岛素-GLase 的胰腺 β 细胞，我们致力于成像。周期性胰岛素分泌，并且能够获得胰岛素分泌具有高葡萄糖反应性变化的克隆，但在周期性胰岛素分泌方面，iGL细胞显示出更接近原代培养细胞的反应。此外，我们应用生物发光成像方法，使用 GLase 融合蛋白来可视化成骨细胞中骨钙素的分泌动态，骨钙素参与促进胰岛素分泌。与局部促进骨形成的 BMP2 相比，骨钙素（已知其在血液中的作用类似于激素）从胞吐位点快速扩散。此外，我们表明，N 末端存在的硫酸乙酰肝素结合位点（碱性氨基酸序列）对于 BMP2 从胞吐位点逐渐扩散是必需的。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Novel Technology for Studying Insulin Secretion: Imaging and Quantitative Analysis by a Bioluminescence Method

研究胰岛素分泌的新技术：生物发光法成像和定量分析

DOI：
10.1248/yakushi.20-00012-2
发表时间：
2020
期刊：
YAKUGAKU ZASSHI
影响因子：
0.3
作者：
Suzuki Takahiro;Kanamori Takao;Inouye Satoshi
通讯作者：
Inouye Satoshi

タンパク質分泌を可視化する生物発光イメージング法

生物发光成像方法可视化蛋白质分泌

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Mukai Satoru;Mizokami Akiko;Otani Takahito;Sano Tomomi;Matsuda Miho;Chishaki Sakura;Gao Jing;Kawakubo-Yasukochi Tomoyo;Tang Ronghao;Kanematsu Takashi;Takeuchi Hiroshi;Jimi Eijiro;Hirata Masato;鈴木崇弘
通讯作者：
鈴木崇弘

生物発光イメージング法を用いた分泌型タンパク質の可視化解析

使用生物发光成像方法对分泌蛋白进行可视化分析