β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞を用いた難治性潰瘍に対する新規再生医療

使用β3整合素基因转移的人表皮角质形成细胞治疗顽固性溃疡的新型再生医学

基本信息

批准号：
20K09847
负责人：
久保美代子
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

難治性潰瘍部には変性コラーゲン（gelatin: GEL）も多く局在する。本年度はGEL上での正常ヒト表皮角化細胞（NHK）とαvβ3発現HKのin vitro細胞増殖について調べた。96 well plateを用いて、4日間の細胞増殖アッセイ(CCK-8 assay)を行った。Sigma社製gelatin (豚皮膚、type A)を2種類の方法：(a)オートクレーブ法（121℃、20分）、(b)煮沸法（50℃、20分）で調整し、種々の濃度(0-20,000 μg/ml)のGEL上でNHKとαvβ3発現HKとを培養した。無血清・低Ca 培地（KGM-Gold BulletKit、Ca濃度: 0.1 mM)を使用した。その結果、NHKの細胞増殖は、両GELともその低濃度 (10-100μg/ml)で著明に減少した。そしてオートクレーブ法での高濃度GEL (1,000-20,000μg/ml) でNHKの細胞増殖の増加はごく軽度であったが、煮沸法での高濃度GEL（1,000-20,000μg/ml）ではNHKの細胞増殖が著明に増加し、αvβ3発現HKのそれと同じ程度であった。またαvβ3発現HKの細胞増殖はNHKに比べて煮沸法での高濃度GEL上でのそれを除くすべてで有意に増加した(Student's t-test: p<0.0001) 。同アッセイ後の細胞形態については細胞増殖が抑制されたNHK（両GELとも10-100μg/ml）で細胞伸展が著明に減少した。加えて、同NHKではF-actin、vinculin分布の著明な減少があった。また、αvβ3発現HKではNHKに比べてフィブロネクチン分布が増加した。さらに、煮沸法GEL高濃度（10,000μg/ml）においてαvβ3発現HKでα5、β3インテグリン発現の増加、NHKでα5インテグリン発現の増加があった。

难治性溃疡中也大量存在变性胶原蛋白（明胶：GEL）。今年，我们研究了正常人表皮角质形成细胞 (NHK) 和表达 αvβ3 的 HK 在 GEL 上的体外细胞增殖。使用 96 孔板进行 4 天细胞增殖测定（CCK-8 测定）。 Sigma生产的明胶（猪皮，A型）通过两种方法制备：（a）高压灭菌法（121℃，20分钟）和（b）煮沸法（50℃，20分钟）以获得不同浓度（NHK和αvβ3） -表达HK在GEL(0-20,000μg/ml)上培养。使用无血清、低 Ca 培养基（KGM-Gold Bullet Kit，Ca 浓度：0.1 mM）。结果，两种 GEL 在低浓度 (10-100 μg/ml) 下，NHK 细胞增殖均显着减少。当使用高压灭菌法使用高浓度GEL（1,000-20,000μg/ml）时，NHK细胞增殖的增加非常轻微，但当使用煮沸法使用高浓度GEL（1,000-20,000μg/ml）时，NHK细胞增殖增加增殖显着增加并且与表达αvβ3的HK相当。此外，除了通过煮沸法得到的高浓度GEL之外，与NHK相比，表达αvβ3的HK的细胞增殖在所有情况下均显着增加（学生t检验：p<0.0001）。关于相同测定后的细胞形态，NHK（两种 GEL 均为 10-100 μg/ml）显着减少了细胞扩散，从而抑制了细胞增殖。此外，NHK 中的 F-肌动蛋白和纽蛋白分布也明显减少。此外，与 NHK 相比，表达 αvβ3 的 HK 中的纤连蛋白分布增加。此外，在高浓度的沸腾GEL（10,000μg/ml）下，表达αvβ3的HK中α5和β3整合素表达增加，并且NHK中α5整合素表达增加。