Basic research on development of novel therapeutic products for hemophilia A and thrombotic disorders based on the regulation of factor VIII function in the blood coagulation

基于VIII因子凝血功能调节的血友病A及血栓性疾病新型治疗产品开发的基础研究

基本信息

批准号：
21K07804
负责人：
野上恵嗣
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

1.第Ⅷ因子-トロンビン制御から見た凝固・抗血栓薬開発の応用：　トロンビンはFⅧのR372, R740, R1689を開裂して活性化させる極めて重要な反応系である。我々はFⅧのK1693N変異がその近傍のR1689開裂を抑制し、その結果、FⅧ活性化障害をきたすFⅧ分子異常症を報告した（日本血液学会総会2022）。P4’領域でトロンビン開裂に影響を及ぼす理由として、N変異が開裂領域に間接的な構造変化をもたらしたと推測するが、今までP4’変異でのトロンビン開裂異常の報告はなく、この変異体蛋白の構造機能を解析し、FⅧ開裂促進・抑制機序のより詳細な解明を現在行っている。2.活性化第Ⅷ因子の活性安定性から見た凝固・抗血栓薬開発の応用：　高活性機能型FⅧの応用： FⅧa-FⅨa結合親和性を高め、内因性FX複合体活性を増強させる変異体の作製に成功した。本変異体はFⅧの安定性を保ち、活性化FⅧからのA2ドメイン解離を遅延させ、野生株に比してFⅧの凝固機能を2倍程度高め、F8KOマウスにおける尾切断出血モデルにおいて止血効果が野生株の4倍近い高凝固能を示した。最終報告論文は国際雑誌（Blood Advances,2023）に掲載された。3.インヒビター結合親和性のアプローチからみた凝固薬開発の応用：　インヒビターに対する高機能FⅧ蛋白の応用: インヒビターの主要エピトープ（A2,C2ドメイン）認識インヒビターの出現時でさえFⅧ機能を発揮するporcine-hybrid変異FⅧ蛋白の作製に成功し、インヒビター反応性をin vitro実験（血漿、全血）にて減弱させ、インヒビター存在下で凝固能を持続することがわかった。本結果を米国血液学会2022で発表した。F8KOマウスを用いたin vivo評価も現在、実施しているところである。

1、从VIII因子-凝血酶调节角度在凝血/抗血栓药物开发中的应用：凝血酶是极其重要的反应系统，可裂解并激活FVIII的R372、R740、R1689。我们报道了一种 FVIII 分子疾病，其中 FVIII 的 K1693N 突变抑制其附近的 R1689 裂解，导致 FVIII 激活受损（日本血液学会会员大会 2022）。我们推测，影响 P4' 区域凝血酶裂解的原因是 N 突变带来了裂解区域的间接结构变化。我们目前正在分析 FVIII 的结构和功能，以阐明促进和抑制的机制。 FVIII 裂解更详细。 2.从活化因子VIII活性稳定性角度进行凝血/抗血栓药物开发应用：高活性功能型FVIII的应用：增加FVIIIa-FIXa结合亲和力、增强内源性FX复合物活性的突变体成功打造。该突变体保持了FVIII的稳定性，延迟了A2结构域与活化的FVIII的解离，使FVIII的凝血功能增加了大约两倍于野生型菌株，并且在尾部截肢出血模型中具有止血作用。 F8KO小鼠表现出高凝血能力，几乎是野生型的四倍。最终报告论文发表在国际期刊上（Blood Advances，2023）。 3. 从抑制剂结合亲和力方法的角度进行凝血药物开发的应用：高功能FVIII蛋白在抑制剂中的应用：识别抑制剂的主要表位（A2、C2结构域）并且即使在抑制剂出现时也表现出FVIII功能的猪杂交体成功创建突变型 FVIII 蛋白并抑制抑制剂反应体外实验（血浆、全血）表明，在抑制剂存在下，凝血能力减弱并得以维持。这些结果已在 2022 年美国血液学会上公布。目前也正在使用 F8KO 小鼠进行体内评估。