急性骨髄性白血病のエクソン・スキップ治療に向けた基盤的研究

外显子跳跃治疗急性髓系白血病的基础研究

• 批准号: 21K07218
• 负责人: 坂下 暁介
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Shimane University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07218/
• 关键词: 急性骨髄性白血病; エクソンスキップ

NPM1.3のスプライシングに携わる領域を同定しNPM1.3の選択率を上昇させる方法論の確立を目指した。NPM1ゲノムのうちExon7-Exon12 (約12kb)をクローニングし、mini geneベクターを作製した。このmini geneをヒト由来の293T細胞に導入すると、NPM1.1とNPM1.3の両方が発現した。mini geneから発現したNPM1.1とNPM1.3の比率（NPM比）を内在性NPM1のNPM比と比較すると、mini geneにおいてNPM1.3の選択率がやや低かったことから、NPM1.3の選択には今回クローニングしたExon7-Exon12の領域以外も関与する可能性が考えられた。しかしながら、ヒトNPM1ゲノムの全長は23kbに及ぶため、遺伝子導入効率の観点から、mini geneのサイズをこれ以上大きくするのは現実的ではないと考えた。そこで、クローニングしたExon7-Exon12の範囲内においてNPM1.3の選択に関与する領域を検討した。その結果、intron7とintron8のいずれかを欠損したmini geneではNPM1.3の選択効率の低下が見られ、intron7とintron8を両方欠損するとさらに低下することが明らかとなった。次にintron7 (約700bp)をいくつかにセクションに分割し、セクションごとに欠損させて、NPｍ1.3の選択効率への影響を検討したが、コントロールとの差は認められなかった。一方、Exon10を同様のアプローチでいくつかのセクションに分割したところ、欠損することによってNPM1.3の選択効率が上昇する領域を同定した。よってこの領域は、通常NPM1.3の選択に対して抑制的に作用するものの、欠損することによって抑制が解除されたと考えられる。

我们的目的是确定参与 NPM1.3 剪接的区域，并建立一种提高 NPM1.3 选择性的方法。克隆 NPM1 基因组的 Exon7-Exon12（约 12 kb）以创建微型基因载体。当将该小基因导入人源性 293T 细胞时，NPM1.1 和 NPM1.3 均得到表达。将小基因​​表达的NPM1.1和NPM1.3的比例(NPM比)与内源NPM1的NPM比例进行比较，发现小基因中NPM1.3的选择率略低，因此选择NPM1.3。人们认为，此次克隆的Exon7-Exon12以外的区域也可能参与其中。然而，由于人类NPM1基因组的总长度为23 kb，从基因转移效率的角度来看，我们认为进一步增加迷你基因的大小是不现实的。因此，我们研究了克隆的 Exon7-Exon12 中涉及 NPM1.3 选择的区域。结果表明，在缺乏内含子7或内含子8的小基因中，NPM1.3的选择效率降低，并且当内含子7和内含子8都缺失时，NPM1.3的选择效率进一步降低。接下来，将内含子7（约700 bp）分成几个部分并在每个部分中删除以检查对NPm1.3选择效率的影响，但没有观察到与对照的差异。另一方面，当我们使用类似的方法将 Exon10 分成几个部分时，我们确定了一个区域，其删除会增加 NPM1.3 的选择效率。因此，虽然该区域通常起到抑制NPM1.3选择的作用，但认为删除该区域可以解除抑制。