活性化プロテインCおよびプロテインS制御による安定化第VIII因子製剤の開発

通过控制活化蛋白C和蛋白S开发稳定因子VIII制剂

• 批准号: 20K08760
• 负责人: 武山 雅博
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08760/
• 关键词: 第VIII因子; 活性化プロテインC; 活性型プロテインC; プロテインS; 血友病

本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型 FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、活性化プロテインC(APC)/プロテインS(PS)の結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤 である。新規FVIII製剤はAPC/PSと の結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。 これまでに、FVIII上のAPC結合部位 の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖(A3ドメイン)アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもとに、FVIII重鎖(A2ドメイ ン)上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。SPR-assayにより、DEGR-APCと400-429ペプチドが結合し、同領域がAPCの結合部位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が420-429ペプ チドの存在により阻害されるかを検討した。420-429ペプチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、420-429ペプチド非存在下と比べて低下しており、420-429ペプチドがAPCの 作用を阻害することを示した。さらに、APCと420-429ペプチドが、EDC クロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することが明らかになった。さらに、western blottingによ りAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることを試みたが、得られたバンドが非常に薄く、アミノ酸シーケンスを断念した。

本研究的目的是进一步阐明FVIII的凝血和抗凝功能，并创造出不易受抗凝功能影响的突变型FVIII，并将其应用于稳定、长效的FVIII制剂。我们瞄准的新FVIII制剂是一种通过突变活化蛋白C（APC）/蛋白S（PS）的结合位点而使用全新机制的制剂。新的FVIII制剂与APC/PS的结合能力较弱，且不太可能被APC/PS灭活，因此被认为比传统的FVIII制剂更稳定且作用时间更长。 到目前为止，我们已经对FVIII上的APC结合位点进行了详细鉴定，并表明APC与FVIII轻链（A3结构域）的氨基酸残基2007-2016结合。基于这些研究，我们进行了研究以确定 FVIII 重链（A2 结构域）上的一个新的 APC 结合位点。 SPR分析显示DEGR-APC和400-429肽结合在一起，表明同一区域是APC的结合位点。 FVIII 被 APC 裂解并失活，我们研究了这种失活是否可以通过 420-429 肽的存在来抑制。在420-429肽存在下，APC对FVIII的灭活低于在不存在420-429肽的情况下，表明420-429肽抑制APC的作用。此外，我们使用蛋白质印迹检查了APC和420-429肽是否通过EDC交联剂结合，结果清楚APC和420-429直接结合。此外，我们尝试使用蛋白质印迹法对APC和420-429肽与EDC交联形成的条带进行氨基酸测序，但获得的条带非常微弱，我们放弃了氨基酸测序。