超分子を用いた疾患および標的組織選択的かつ全身投与可能なゲノム編集技術の構築

使用超分子构建疾病和靶组织选择性和系统可管理的基因组编辑技术

基本信息

批准号：
21K06672
负责人：
本山敬一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06672/
关键词：
ゲノム編集ロタキサン超分子シクロデキストリン

项目摘要

CRISPR-Cas9 は、革新的なゲノム編集技術であるが、安全性に優れる非ウイルキャリアによる全身投与可能なゲノム編集に成功した事例はほとんどない。ゲノム編集誘導のためには、近年、Cas9 タンパク質と sgRNA の複合体 (Cas9 RNP) をあらかじめ形成させ、細胞内に直接導入する方法が試みられている。そこで我々は次世代型 Cas9 RNP キャリアとして、ポリロタキサン (PRX) という超分子素材に注目した。PRX とは、複数の環状分子に貫通した軸分子の両末端を嵩高い分子で塞いだ超分子化合物である。PRX は柔軟性が高く、軸分子に沿って環状分子が回転・移動できるため、環状分子にアミノ基を導入すると、タンパク質や核酸の立体構造に合わせて変形し、オンデマンドにアミノ基を提示する結果、非常に高効率に複合体を形成可能性である。本研究の目的は、アミノ化ポリロタキサン(NH2-PRX)を用いて、全身投与で疾患や標的組織特異的に Cas9 RNP をデリバリー可能な基盤技術を構築し、安全かつ高効率な in vivo ゲノム編集技術の開発を行うことである。本研究では、Cas9 RNP キャリアとしてのNH2-PRXについて、細胞内で積極的なCas9 RNPのリリースを達成するために、NH2-PRXに種々の結合様式（ヒドラゾン結合、エステル結合、アセタール結合など）を導入して、更なる構造最適化を行った。その結果、ジスルフィド結合とカルバメート結合を導入することにより、細胞内でエンドソーム脱出効果およびCas9 RNPのリリース能を獲得することに成功した。さらに、本年度は、最適化したNH2-PRXにリガンド修飾を施し、細胞へのターゲティング獲得に関する研究を展開した。

CRISPR-Cas9是一种创新的基因组编辑技术，但使用高度安全的非病毒载体进行系统性基因组编辑的成功例子很少。为了诱导基因组编辑，最近有人尝试预先形成Cas9蛋白和sgRNA（Cas9 RNP）的复合物，并将其直接引入细胞中。因此，我们专注于一种称为聚轮烷（PRX）的超分子材料作为下一代Cas9 RNP载体。 PRX是一种超分子化合物，其轴分子延伸穿过多个环状分子，两端都塞满了大分子。 PRX具有高度柔性，环状分子可以沿着轴分子旋转和移动，因此当环状分子中引入氨基时，它会变形以匹配蛋白质或核酸的三维结构，并将氨基呈现在环状分子上。因此，可以形成效率非常高的综合体。本研究的目的是构建一种利用胺化聚轮烷（NH2-PRX）进行全身给药，以疾病和靶组织特异性方式递送Cas9 RNP的基础技术，并开发一种安全、高效的体内基因组编辑方法。目标是发展技术。在本研究中，我们研究了NH2-PRX作为Cas9 RNP载体，通过将各种键合方式（腙键、酯键、缩醛键等）连接到NH2-PRX上，以实现Cas9 RNP在细胞内的主动释放。结构进一步优化。结果，通过引入二硫键和氨基甲酸酯键，我们成功获得了内体逃逸效应和在细胞内释放Cas9 RNP的能力。此外，今年我们还开展了NH2-PRX的优化研究，通过配体对其进行修饰以获得对细胞的靶向。