Study of temperature resistant mechanisms of papain enzymes by single-molecule measurements

单分子测量研究木瓜蛋白酶的耐温机制

基本信息

批准号：
21K06115
负责人：
梅村和夫
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

酵素パパインの耐熱性について、原子間力顕微鏡（AFM）による1分子液中観察実験と、単層カーボンナノチューブ（SWNT）の近赤外発光（PL）を用いたスペクトル測定実験、さらにデジタルホログラフィック顕微鏡、近赤外顕微鏡による観察実験も試みた。研究成果として、第一に、昨年行ったAFM観察実験について、査読付き論文1報を発表し、国内外での学会発表も行った。第二に、昨年度は室温での液中AFM観察にとどまっていたが、今年度は温度を変化させての液中AFM観察を行うことができた。基板上に孤立して吸着させた個々のパパイン分子を、まず室温の緩衝液中でAFM観察し、続いて液温を37度に温度を上昇させて再観察すると、パパイン分子の体積が大きくなる（膨らむ）ことが明らかになった。続いて温度を室温に戻すと、体積はやや減少するが、完全に元通りにはならなかった。今のところ現象論にとどまっているが、温度を変化させての観察手順が確立されてきたため、同様の手順で活性化したパパイン分子なども観察できると考えられる。第三に、DNAで単分散したSWNTを静電力によってナノ多孔質バイオシリカ（珪藻殻）表面に吸着させ、マイクロデバイス化した。最初に酸化剤でSWNTを消光しておき、その分散液にパパインを添加したところ、SWNTの発光が回復することが分かった。これはパパインの抗酸化能を示していると解釈できる。比較のために還元剤であるジチオスレイトール（DTT）を添加すると、この場合もPL発光が回復した。ただし、パパインとDTTでは、発光回復の度合いがSWNTのキラリティごとに異なり、発光スペクトルによりパパインとDTTを識別できることが分かった。

关于木瓜蛋白酶的耐热性，我们使用原子力显微镜（AFM）进行了液体中的单分子观察实验、使用单壁碳纳米管（SWNT）的近红外发射（PL）的光谱测量实验以及我们还尝试使用近红外显微镜进行观察实验。作为研究成果，我们首先发表了一篇关于去年进行的AFM观察实验的同行评审论文，并在日本和国外的学术会议上发表了论文。其次，虽然去年我们仅限于在室温下进行液体 AFM 观察，但今年我们能够在不同温度下进行液体 AFM 观察。当在室温下在缓冲溶液中首先用AFM观察单独吸附在基质上的单个木瓜蛋白酶分子，然后在将溶液的温度升高到37度后再次观察时，木瓜蛋白酶分子的体积变得更大。它是（扩展）。当温度随后恢复至室温时，体积略有减小，但并未完全恢复至原始状态。目前，这仍然是一种现象学理论，但由于已经建立了使用不同温度的观察程序，因此认为也可以使用相同的程序来观察活化的木瓜蛋白酶分子。第三，利用静电力将单分散有 DNA 的 SWNT 吸附到纳米多孔生物二氧化硅（硅藻壳）的表面上，以制造微型器件。当首先用氧化剂猝灭单壁碳纳米管并向分散体中添加木瓜蛋白酶时，发现单壁碳纳米管的发光恢复了。这可以解释为表明木瓜蛋白酶的抗氧化能力。为了进行比较，当添加还原剂二硫苏糖醇（DTT）时，在这种情况下PL发射也恢复了。然而，对于木瓜蛋白酶和DTT，发光恢复程度根据SWNT的手性而不同，并且发现木瓜蛋白酶和DTT可以通过它们的发射光谱彼此区分。