心疾患に関連する新奇生理活性物質 D-グルタミン酸の分解酵素に関する研究

与心脏病相关的新型生理活性物质D-谷氨酸降解酶的研究

基本信息

批准号：
21K06085
负责人：
片根真澄
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）の分解酵素として最近同定した、哺乳類 D-Glu シクラーゼ（DGLUCY；D-Glu を 5-オキソ-D-プロリン［5-オキソ-D-Pro］と水に分解する反応を可逆的に触媒する酵素）の代謝機構の全貌を解明することである。この目的に向けて、DGLUCY 活性の迅速で簡便な測定法の開発のほか、DGLUCY の構造機能相関の解明を試みる。2021 年度には、吸光度計を用いた比色定量に基づく迅速で簡便な DGLUCY 活性の新規測定法について解析した。その結果、5-オキソ-D-Pro の 2-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩による誘導体化反応の最適な条件を決定した。また、比色定量法による 5-オキソ-D-Pro の感度を解析した。その結果、96-well プレートを用いた比色定量法が、我々が以前に開発した高速液体クロマトグラフィーを用いた測定法（HPLC-UV 法）よりも低感度である一方で、384-well プレートを用いた比色定量法は HPLC-UV 法よりも高感度であることが明らかになった。2022 年度は、比色定量法が、DGLUCY の酵素活性の測定に適用可能かどうかを解析した。すなわち、比色定量法を用いてマウス組換え DGLUCY の D-Glu に対する動力学定数を決定し、HPLC-UV 法を用いて決定した値と比較した。その結果、比色定量法を用いて DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることが明らかになった。また、野生型および DGLUCY ノックアウトマウスそれぞれから樹立した培養細胞株の抽出液を酵素源として DGLUCY 活性を測定することにより、本法の正確性とともに頑健性を解析した。その結果、比色定量法を用いて細胞可溶化液中における DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることが明らかになった。

本研究的目的是开发哺乳动物 D-Glu 环化酶（DGLUCY），该酶最近被鉴定为游离 D-谷氨酸（D-Glu）的降解酶。该项目的目的是阐明 D-Glu 的整个代谢机制。可逆地催化分解 Pro 和水的反应的酶。为此，我们将开发一种快速简便的DGLUCY活性测定方法，并尝试阐明DGLUCY的结构-功能关系。在 2021 财年，我们分析了一种测量 DGLUCY 活性的新方法，该方法基于使用吸光度计的比色测定，快速简便。因此，我们确定了 5-oxo-D-Pro 与 2-硝基苯肼盐酸盐衍生化反应的最佳条件。我们还使用比色法分析了 5-oxo-D-Pro 的灵敏度。因此，使用 96 孔板的比色法的灵敏度低于我们之前开发的基于高效液相色谱的测量方法（HPLC-UV 法），而 384 孔板的比色法则表明，比色法的灵敏度较低。使用 HPLC-UV 方法的方法比 HPLC-UV 方法更灵敏。 2022年，我们分析了是否可以应用比色法来测量DGLUCY的酶活性。即，使用比色法测定小鼠重组DGLUCY对于D-Glu的动力学常数，并与使用HPLC-UV法测定的值进行比较。结果表明，使用比色法可以准确测量 DGLUCY 的酶活性。我们还通过使用野生型和 DGLUCY 敲除小鼠建立的培养细胞系的提取物作为酶源测量 DGLUCY 活性，分析了该方法的准确性和稳健性。结果表明，使用比色法可以准确测量细胞裂解液中 DGLUCY 的酶活性。

项目成果

期刊论文数量（19）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase regulates the free D‐aspartate level in mammalian cells

乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶调节哺乳动物细胞中游离 D-天冬氨酸水平

DOI：
10.1002/jcb.30110
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
4
作者：
Katane Masumi;Matsuda Satsuki;Saitoh Yasuaki;Miyamoto Tetsuya;Sekine Masae;Sakai‐Kato Kumiko;Homma Hiroshi
通讯作者：
Homma Hiroshi

超好熱菌 Thermotoga maritima の O-アセチルホモセリンスルフヒドラーゼの D-アミノ酸代謝能の解析

超嗜热菌海栖热袍菌O-乙酰高丝氨酸硫化酶D-氨基酸代谢能力分析