がん悪性化における腎癌部由来エクソソーム特異的分子の機能解明

阐明肾癌衍生的外泌体特异性分子在癌症恶性肿瘤中的功能

• 批准号: 20K07647
• 负责人: 大西 なおみ
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Japanese Foundation for Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K07647/
• 关键词: エクソソーム; 腎癌; CA9; 腎細胞癌

申請者は外科的に切除された新鮮腎癌組織が分泌するエクソソームを特殊培養下で増幅し直接回収する手法を開発し、その網羅的定量プロテオーム解析から腎癌組織由来エクソソームにおいて特異的な発現を認めるタンパク質CA9を同定した。CA9は腎癌組織においても高発現する癌関連抗原として知られ、特にCA9高発現群は低発現群と比較して、再発率、全生存期間の両面で著しく予後不良となることが報告されているが 、その分子メカニズムは明らかになっていない。そこで本研究では、腎癌細胞中CA9および腎がん細胞由来エクソソーム中のCA9が腎癌悪性化に及ぼす影響を分子生物学的に明らかにすることを目指し本研究計画を立案した。まず、CA9は正常腎組織には全く発現しないが、ヒト体内においては正常消化管上皮組織に内因性の発現が認められる。消化管上皮においてCA9は生理的に低酸素条件下でHIF1分子依存的に発現誘導されることが知られている。しかし、申請者の検討により、腎癌組織におけるCA9の発現誘導はHIF1誘導に非依存的であり、HIF1を介さない新しいCA9の発現機構が存在する知見を得た。そこでまず、CA9強制発現ベクターおよび発現抑制ベクターを作製し、内因性のCA9発現量が異なる様々な腎癌細胞株に導入することで腎癌組織中のCA9量や発現を制御する上流分子パスウェイの解析を進めた。次に、CA9はCAドメインを介して細胞外のCO2を水和し、細胞外pHを酸性側に調節することが知られ、癌環境の酸性化は上皮細胞にEMTを誘導し癌の浸潤や転移の促進に寄与することがよく知られている。そこで本研究では腎癌細胞のEMT誘導に着目し、外科的に切除された新 鮮腎癌組織片とCA9強制発現ベクターを導入したCAF細胞を共培養し、腎癌細胞にEMTが誘導されるか否かをE-cadherinの発現低下ならびにSNAILの発現上昇等を指標として解析を行った。

申请人开发了一种在专门培养物中通过手术切除的新鲜肾癌组织分泌的扩增和直接恢复外泌体的方法，并鉴定出一种特定于外泌体肾脏癌组织的外泌体的蛋白CA9。 CA9被称为癌症相关的抗原，在肾脏癌组织中高度表达，尽管据报道，与低表达组相比，CA9高表达组在复发率和整体生存方面的预后明显较差，但其分子机制的分子机制尚未澄清。因此，在这项研究中，我们制定了该研究计划，以分子阐明CA9在肾脏癌细胞和CA9中的影响，在肾脏癌细胞衍生的外泌体对肾脏癌的恶性肿瘤中的影响。首先，在正常的肾脏组织中根本不表达CA9，但是在人体的正常胃肠道上皮组织中观察到内源性表达。众所周知，CA9是在胃肠道上皮的低氧条件下以HIF1分子依赖性方式诱导的。然而，申请人的综述表明，肾脏癌组织中CA9表达的诱导与HIF1诱导无关，并且一种不介导HIF1的新的Ca9表达机制。首先，我们准备了CA9强制表达载体和抑制载体的表达，并分析了上游分子途径，该途径通过将其引入具有不同内源性CA9表达水平的各种肾脏癌细胞系中来调节肾脏癌组织中的Ca9水平和表达。接下来，已知CA9通过CA结构域进行水分的细胞外CO2进行水合，并调节细胞外pH向酸性侧进行，众所周知，癌症环境的酸化会在上皮细胞中诱导EMT，从而促进癌症的侵袭和转移。因此，在这项研究中，我们专注于EMT诱导肾癌细胞，并使用与CA9强制表达载体一起引入的新的肾脏癌组织片段和CAF细胞用于分析是否使用E-Cadherin的表达降低表达和蜗牛作为指示剂来分析肾脏癌细胞中是否诱导EMT。