Basic research on advanced utilization of squid by elucidating the properties of muscular protein, paramyosin

阐明肌肉蛋白、副肌球蛋白的特性，进行鱿鱼先进利用的基础研究

• 批准号: 21K05429
• 负责人: 福島 英登
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05429/
• 关键词: リコンビナント・パラミオシン; イカ筋肉由来パラミオシン; イカ肉加熱品; 筋肉タンパク質の分解; パラミオシン; 加熱ゲル化特性; リコンビナントタンパク質; アメリカオオアカイカ; アカイカ

前年度作製した、アカイカおよびアメリカオオアカイカのパラミオシン発現用大腸菌を用いて、リコンビナント・パラミオシン(rPm)の発現および精製条件を検討した。初めに発現用大腸菌をLB液体培地37℃で約2時間かけ対数増殖期まで振盪培養した。その後、①終濃度500μMのIPTGを添加し37℃で3h誘導、②終濃度500μMのIPTGを添加し25℃で24h誘導、③終濃度50μMのIPTGMを添加し20℃で96h誘導の3条件で発現誘導した。誘導後集菌した菌体を高イオン強度緩衝液中で超音波破砕し、遠心分離によりrPmを含む上清を得た。低イオンおよび高イオン強度緩衝液に対する透析と再溶解後に遠心分離に供しrPmを精製した。各精製工程で標品を採取し、SDS-PAGEによりrPmの精製度合いを確認した。この他に、SDS-PAGEによりイカ筋肉由来のパラミオシンとrPmを比較した。また、タンパク質比色定量であるBCA法によりタンパク質収量を調べた。SDS-PAGEから①の条件では、rPmの発現は確認できたが、菌体破砕後、上清中にごく少量しか確認できなかった。すなわちこの条件では封入体が形成されrPmを回収することが困難であった。②および③の条件でもrPmの発現が確認できたが、③の菌体の方がrPmの発現量が多かった。以上の結果、本研究で構築したrPm発現系は、IPTG濃度を終濃度50μMに抑え、20℃の低温で96hという長時間の誘導が封入体の形成抑制に効果的であり、効率よくrPmを発現することが分かった。③の発現誘導後のタンパク質収量は800mlのLB液体培地に対して、アカイカrPmは12.1mg、アメリカオオアカイカrPmは16.2mgであった。今後は本手法で調製したrPmを用いて、動的粘弾性測定装置を用いた加熱ゲル形成過程の解析に取り組む。

使用大肠杆菌表达前一年制备的红鱿鱼和巨型鱿鱼的副肌球蛋白，研究了重组副肌球蛋白（rPm）的表达和纯化条件。首先，将表达用大肠杆菌在LB液体培养基中于37℃振荡培养约2小时直至对数生长期。之后进行以下三个条件：（1）添加IPTG终浓度500μM，37℃诱导3小时，（2）添加IPTG终浓度500μM，25℃诱导24 (3)加入终浓度50μM的IPTGM，20℃诱导96小时。诱导后，将收集的细胞在高离子强度缓冲液中用超声波破碎，并通过离心获得含有rPm的上清液。 rPm 通过低离子和高离子强度缓冲液透析并重新溶解然后离心来纯化。在每个纯化步骤收集样品，并通过 SDS-PAGE 确认 rPm 的纯化程度。另外，通过SDS-PAGE比较来自鱿鱼肌肉的副肌球蛋白和rPm。此外，使用 BCA 方法（一种比色蛋白质测定法）检查蛋白质产量。虽然在条件①下通过SDS-PAGE确认了rPm的表达，但在破碎细菌细胞后的上清液中只能确认少量rPm的表达。即，在这些条件下，形成包涵体并且难以回收rPm。虽然在条件②和条件③下确认了rPm表达，但条件③的细菌细胞中rPm表达量较高。结果，本研究构建的rPm表达系统将IPTG浓度抑制至终浓度50μM，并在20℃低温下诱导96小时的长期诱导，有效抑制了IPTG的形成。发现包涵体有效地表达rPm。 ③表达诱导后，在800ml LB液体培养基中，红鱿鱼rPm的蛋白产量为12.1mg，红鱿鱼rPm的蛋白产量为16.2mg。今后，我们将利用该方法制备的rPm，利用动态粘弹性测量装置来分析加热凝胶形成过程。

项目成果

イカ類外套膜を原料としたユニバーサルデザインフードの製造条件に関する研究

以乌贼外套膜为原料的通用设计食品生产条件研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 西山由真;福島英登;松宮政弘
• 通讯作者: 松宮政弘

切り身およびミンチ処理スルメイカ肉の 冷凍貯蔵耐性の比較

鱿鱼片和肉末的冷冻保存性能比较

• 发表时间: 2022
• 作者: 福島英登;田野百絵;石橋大星;北川翔;松宮政弘
• 通讯作者: 松宮政弘

イカ類外套膜を原料としたユニバーサルデザインフードの製造条件に関する研究

以乌贼外套膜为原料的通用设计食品生产条件研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 西山由真;福島英登;松宮政弘
• 通讯作者: 松宮政弘

切り身およびミンチ処理スルメイカ肉の 冷凍貯蔵耐性の比較

鱿鱼片和肉末的冷冻保存性能比较

• 发表时间: 2022
• 作者: 福島英登;田野百絵;石橋大星;北川翔;松宮政弘
• 通讯作者: 松宮政弘