Molecular basis and functional modulation of carbohydrate epimerases and isomerases useful for carbohydrate conversion

用于碳水化合物转化的碳水化合物差向异构酶和异构酶的分子基础和功能调节

基本信息

批准号：
21K05388
负责人：
佐分利亘
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

糖質の高度利用には，希少糖質の効率合成法が必要である.本研究ではセロビオース2-エピメラーゼ (CE酵素) やマンノースイソメラーゼなど様々な糖質異性化酵素を含む酵素群の反応特異性を制御する機構の解明と高活性変異酵素の開発を目的とした.エピメラーゼ活性のみを示すCE (1機能CE酵素) とエピメラーゼ活性とイソメラーゼ活性を示す2機能CE酵素の間で構造領域を入れ換えた一連のキメラ酵素のうち，(α/ α)6バレル触媒ドメインを構成するα-ヘリックス1と2，3と4，5と6を入れ替えたキメラ酵素の機能を解析した．Glcβ-4ManとGlcβ-4Fruに対する初速度に基づき2機能CE酵素に1機能CE酵素のα-ヘリックス1と2，3と4を入れ換えたキメラ酵素は野生型2機能酵素よりも低いイソメラーゼ特異性を示した.すなわち，α-ヘリックス１から4に至る領域がイソメラーゼ反応に重要な構造を含むことが示唆された．マンノースエピメラーゼ (ME酵素) については高活性変異酵素のハイスループットスクリーニング系の評価を行った．ME酵素をマンノース取り込み能を欠失させた大腸菌の細胞表層に発現させたところ，この細胞懸濁液中でのManの減少を確認した．すなわち，マンノースは菌体外ME酵素によるグルコースへの異性化を介して菌体に取り込まれたと理解された．またこの大腸菌形質転換体はマンノースを唯一の炭素源として生育した．組換えME酵素のC末端側にGFPタンパク質を融合し，菌体表層中のME酵素の簡便な定量方法を構築した．ランダム変異を導入したME変異酵素ライブラリーをグルコースとマンノースを唯一の炭素源とする培地で生育させるとマンノース培地でのコロニー数はグルコース培地でのコロニー数の5%程度であり，低活性変異酵素はマンノース培地で生育できずに除外されることが示唆された．

碳水化合物的高级利用需要稀有碳水化合物的有效合成方法。在本研究中，我们研究了一组酶的反应特异性，包括各种碳水化合物异构酶，例如纤维二糖2-差向异构酶（CE酶）和甘露糖异构酶。控制CE并开发高活性突变酶的机制。CE仅表现出差向异构酶活性（单功能CE酶）在一系列具有差向异构酶和异构酶活性的双功能 CE 酶之间交换结构区域的嵌合酶中，α-螺旋 1 和 2、3 和 4 构成 (α/α)6 桶催化结构域，我们分析了5 和 6 交换的嵌合酶的功能。基于Glcβ-4Man和Glcβ-4Fru的初始速度，单功能CE酶的α-螺旋1和2、3和4被双功能CE酶取代的嵌合酶的异构酶特异性低于野生型换句话说，α-螺旋1至4的区域含有对异构酶反应重要的结构。关于甘露糖差向异构酶（ME酶），我们评估了高活性突变酶的高通量筛选系统。当 ME 酶在缺乏吸收甘露糖能力的大肠杆菌细胞表面表达时，我们证实细胞悬浮液中的 Man 减少。换句话说，可知甘露糖通过胞外ME酶异构化为葡萄糖而被摄入细菌细胞内。此外，这种大肠杆菌转化体使用甘露糖作为唯一碳源生长。通过将 GFP 蛋白融合到重组 ME 酶的 C 端侧，我们构建了一种定量细菌细胞表面 ME 酶的简单方法。当含有随机突变的ME突变体酶文库在以葡萄糖和甘露糖为唯一碳源的培养基中生长时，甘露糖培养基上的菌落数约为葡萄糖培养基上菌落数的5%，表明突变体酶活性低，表明该物种不能在甘露糖培养基上生长并被排除。