オンサイトで迅速に利用可能な核酸抽出不要の微生物解析技術の開発

开发可现场快速使用、无需核酸提取的微生物分析技术

基本信息

批准号：
21K04328
负责人：
川上周司
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Nagaoka National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

水環境中の細菌群において、その存在数をモニタリングする方法としてはrRNA遺伝子やtuf遺伝子の遺伝子数を定量するreal-time PCR法がある。しかしながら遺伝子定量を行うためには細菌の細胞からDNAを取り出す必要があり、さまざまな種類の細胞構造から普遍的にDNAを抽出することが難しいことから、その測定結果には抽出効率によるバイアスを含むことになる。本研究ではDNA aptamerとreal-time PCR法を組み合わせることでDNA抽出を介さずに試料中の任意の細菌数を定量できないかと考えた。本研究では、初期検討として、段階希釈で作成した存在数の異なる細菌サンプルを作成し、それらに結合したaptamerの数をreal-time PCRで計測することで開発を目指す技術の実現可能性を検討した。段階希釈したE.coliに対しP12-55 aptamerを結合させ、熱変性によって剥がしたaptamerの数をreal-time PCRで計測した。結果、すべてのサンプルからaptamerの検出に成功した。ただ、初期菌体量とPCR増幅の立ち上がりにおけるサイクル数 (Ct値) の両者間には、通常の遺伝子定量時における検量線サンプルで見られるような均等な間隔での立ち上がりにはならなかった。これは細菌の段階希釈において細胞固定を行わなかったことが原因であると思われ、実験過程の中でも細菌の増殖が見られたことなどが要因と考えられる。それでも10^8 cell/mLが最も増幅曲線の立ち上がりが早く、段階希釈に応じてその立ち上がりは遅くなっていく傾向が見えた。このことから、初期菌体量とaptamerの量には相関がみられ、細菌数を定量できる可能性を示すものと判断した。

作为监测水环境中存在的细菌数量的方法，有一种实时PCR方法，可以定量rRNA基因和tuf基因的数量。然而，为了定量基因，需要从细菌细胞中提取DNA，并且由于很难从各种类型的细胞结构中普遍提取DNA，因此测量结果因提取效率而存在偏差。在本研究中，我们考虑是否可以通过结合 DNA 适体和实时 PCR 来定量样品中任意细菌的数量，而无需提取 DNA。在这项研究中，作为一项初步研究，我们将通过连续稀释创建具有不同数量细菌的细菌样本，并使用实时 PCR 测量与其结合的适体数量，来检验我们旨在开发的技术的可行性。 P12-55适体与连续稀释的大肠杆菌结合，通过实时PCR测量热变性去除的适体数量。结果，在所有样品中均成功检测到适配体。然而，在初始细菌质量和 PCR 扩增开始时的循环数（Ct 值）之间，启动并不是以正常基因定量过程中标准曲线样品所见的相等间隔发生的。这被认为是由于在细菌的连续稀释过程中没有进行细胞固定，并且在实验过程中观察到细菌生长的事实也被认为是一个促成因素。即便如此，扩增曲线在 10^8 个细胞/mL 时上升最快，并且随着连续稀释度的增加，上升趋势趋于减慢。由此确定初始细菌质量与适体量之间存在相关性，表明定量细菌数量的可能性。