自家移植を目指した機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養表皮の開発

用于自体移植的含有功能性小汗腺的三维培养表皮的开发

• 批准号: 21K09769
• 负责人: 亀田 健治
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09769/
• 关键词: 再生医療; エクリン汗腺; 三次元培養; 三次元培養皮膚; エクリン汗管細胞; 皮膚再生医療

本研究の目的は、現在までに改良されてきた皮膚三次元培養表皮をさらに進化させ、機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養皮膚の新規作成法を確立し、臨床応用を目指すことである。我々は、さらにエクリン汗腺の機能を有する次世代型の表皮シートあるいは自家培養皮膚の開発を目指す点において独自性・独創性がある。今回我々は、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる次世代型の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すが、その結果を国内国外へ発信することで、多数の皮膚疾患患者に対する臨床応用へ発展されていくことを強く切望する。多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺を維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによりTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3などのマーカーによりソーティングにて同定・回収する。免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認する。エクリン汗管細胞及び腺房細胞を、オルガノイド培養法・マトリゲル培養にてスフェロイド培養を行なう。その後エクリン汗腺細胞から組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行なう。

这项研究的目的是进一步进化迄今已改进的三维培养表皮，建立一种新的方法来创建含有功能性eccrine汗腺的三维培养皮肤，并旨在临床应用。我们也是独特的和原始的，目的是开发出具有Eccrine汗腺或自体培养的皮肤功能的下一代表皮表。我们旨在创建下一代三维培养的皮肤模型，该模型可以完全有助于未来的基础研究和临床应用，但我们强烈希望通过将结果发送到日本和国外，它将被发展为许多皮肤病患者的临床应用。分离并从多态度患者获得的指尖分离并培养出在维持Eccerine汗腺同时生长的汗水管和汗腺细胞，并通过标记保留方法和免疫染色来鉴定并分离所含的干细胞。该方法涉及从FAD培养基中诱导角蛋白阳性细胞，然后添加BMP和抗坏血酸诱导角蛋白阳性细胞，然后更改为角蛋白样细胞，以增加角蛋白细胞的增殖，从而减少伴充质细胞的比例，从而减少一个月或更多一个月或更多一个月或更多一个月或更多一个月。使用在存在表皮干细胞的基础层中常见的K5阳性细胞分离的条件分离细胞。使用Tra-1-60，Tra-1-81和SSEA3等标记，通过流式细胞仪鉴定并收集分离分离后已重生的分离细胞中的多能干细胞（PSC）。免疫染色证实了生长细胞的性质。 Eccerine汗管细胞和腺泡细胞是使用类带培养和矩阵培养的球体培养的。然后，为了诱导从Eccerine汗腺细胞分化为组织，使用人角膜化细胞或三维培养的表皮形成，在单层培养过程中插入和共培养eccerine汗腺的球体，并诱导表皮内的汗水管形成，就像在正常的气相中一样。