新規Z型テルペン生合成酵素群の発掘による新規生理活性物質の発見

通过发现新型Z型萜烯生物合成酶群,发现新的生理活性物质

基本信息

  • 批准号:
    21J14050
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.96万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2021
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2021-04-28 至 2023-03-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究では、報告例がごく僅かであるZ型テルペン生合成酵素の発見から、新規生理活性物質の発掘への展開を目指す。申請者らは、既知酵素との類似性のない新型の「Z型環化酵素」と、Z型二重結合を還元する初めての酵素である「Z型還元酵素」を抗酸菌から見出しており、両酵素の同定を第一の目標とする。加えて、結晶構造や変異導入実験を行い、立体構造や活性部位モチーフを明らかにする。その後、Z型環化・還元酵素を基にゲノムマイニングを行い、新規性の高いテルペンを数多く見出す。見出された新規テルペンについては生理活性を解析し、有用なテルペンを新たに発見する。これによって、「生合成的に新規性の高い天然物の探索→新規性の高い酵素の発見→新規生理活性物質の発見」の流れの有効性を示す。昨年度同定した「Z型還元酵素」について、大腸菌組換え酵素や抗酸菌発現系を用いた基質特異性や諸性質の解析を進めたところ、本酵素がZ,E混成型イソプレノイドのZ型だけでなくE型の二重結合も還元する初めての酵素であることを明らかにできた。また、ホモログ酵素の解析から、Z型二重結合のみを特異的に還元する酵素の同定に成功したことも成果のひとつである。「Z型環化酵素」の探索に関しては、当初計画していたショットガンクローニングが難航したため、方針を転換し、硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどによってネイティブな酵素精製を進めた。部分精製画分が得られたため、これをLC-MS/MSによって解析し、4種の候補タンパク質を見出すことができた。これらの候補遺伝子を大腸菌や抗酸菌発現ベクターにクローニングし、現在、酵素活性の解析を進めている。
在本研究中,我们的目标是将目前报道较少的Z型萜烯生物合成酶的发现发展为新的生理活性物质的发现。申请人从我们的抗酸细菌中发现了一种与已知酶没有相似性的新型“Z型环化酶”,以及第一种还原Z型双键的酶“Z型还原酶”。主要目标是鉴定这两种酶。此外,我们还将进行晶体结构和突变引入实验,以阐明三维结构和活性位点基序。随后,我们基于Z型环化/还原酶进行基因组挖掘,发现了许多高度新颖的萜烯。我们将分析新发现的萜烯的生理活性并发现新的有用的萜烯。这证明了“寻找生物合成新颖的天然产物→发现高度新颖的酶→发现新颖的生理活性物质”流程的有效性。对于去年鉴定出的“Z型还原酶”,我们利用大肠杆菌重组酶和抗酸细菌表达系统分析了底物特异性和各种特性,发现这种酶是Z,E的Z型所特有的。我们能够证明这是第一种不仅能还原 E 型双键,还能还原 E 型双键的酶。另一项成就是通过同源酶分析成功鉴定出一种仅特异性还原 Z 型双键的酶。关于“Z型环化酶”的寻找,原本计划的鸟枪克隆失败了,所以我们改变了策略,开始通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和羟基磷灰石层析来纯化天然酶。获得部分纯化的级分,通过 LC-MS/MS 对其进行分析,发现了四种候选蛋白质。我们已将这些候选基因克隆到大肠杆菌和抗酸细菌表达载体中,目前正在分析它们的酶活性。

项目成果

期刊论文数量(38)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
第5回抗酸菌研究会
第五分枝杆菌研究组
  • DOI:
  • 发表时间:
    2021
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    ○阿部 透;袴田 真理子;西山 晃史;立石 善隆;松本 壮吉;邊見 久;上田 大次郎;佐藤 努
  • 通讯作者:
    佐藤 努
抗酸菌由来のZ型プレニル基を還元する新しいタイプの酵素の同定
鉴定一种新型酶,可减少源自抗酸细菌的 Z 型异戊二烯基团
  • DOI:
  • 发表时间:
    2022
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    ○阿部 透; 若松 のぞみ; 西山 晃史; 松本 壮吉; 上田 大次郎; 佐藤 努
  • 通讯作者:
    佐藤 努
Identification and functional analysis of a new type of Z,E-mixed prenyl reductase from mycobacteria
分枝杆菌新型Z、E混合异戊二烯还原酶的鉴定及功能分析
  • DOI:
    10.1111/febs.16412
  • 发表时间:
    2022
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Abe; T.; Hakamata; M.; Nishiyama; A.; Tateishi; Y.; Matsumoto; S.; Hemmi; H.; Ueda; D.;Sato; T.
  • 通讯作者:
    T.
Identification and functional analysis of a new type of Z,E-mixed prenyl reductase from mycobacteria
分枝杆菌新型Z、E混合异戊二烯还原酶的鉴定及功能分析
  • DOI:
    10.1111/febs.16412
  • 发表时间:
    2022
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Abe; T.; Hakamata; M.; Nishiyama; A.; Tateishi; Y.; Matsumoto; S.; Hemmi; H.; Ueda; D.;Sato; T.
  • 通讯作者:
    T.
抗酸菌由来 E 型イソプレニル二リン酸合成酵素群の機能解析
抗酸细菌E型异戊二烯基二磷酸合酶的功能分析
  • DOI:
  • 发表时间:
    2021
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    阿部 透;上田 大次郎;○佐藤 努
  • 通讯作者:
    ○佐藤 努
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  • 影响因子:
    0
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  • 通讯作者:
    佐藤 努
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  • 发表时间:
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  • 期刊:
  • 影响因子:
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  • 作者:
    阿部 透;上田 大次郎;佐藤 努
  • 通讯作者:
    佐藤 努

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    $ 0.96万
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