水素結合ネットワークに着目した青色光受容タンパク質ファミリーの機能制御機構の解明

以氢键网络为重点阐明蓝光受体蛋白家族的功能控制机制

• 批准号: 21J13329
• 负责人: 細川 雄平
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13329/
• 关键词: 光受容; タンパク質内電子移動; 電荷分離; 構造機能相関; 分子進化; 光回復酵素; クリプトクロム

本研究ではゲノム恒常性や概日リズム形成に関与する青色光受容タンパク質ファミリーである光回復酵素・クリプトクロムスーパーファミリーの機能制御機構に着目した。特に、シロイヌナズナ由来の(6-4)光回復酵素 (At64) と、ショウジョウバエ由来のクリプトクロム (DmCRY) の2つのタンパク質に注目した。両者はともに、補因子であるフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）とトリプトファン残基との間で光依存的に電荷分離状態を形成し、その後、FADを還元することが知られている。この光依存的な還元反応が当該タンパク質ファミリーの多様な機能を制御していると考えられている。本研究課題を通じて、申請者はAt64が例外的に安定的な電荷分離状態を作り出すことを見出し、その安定化機構をナノ秒オーダーの時間分解測定を含む分光学的測定と分子動力学計算を組み合わせることで新規に解明し、論文報告した。一方で、DmCRYは光依存的構造変化に伴って立体構造を変化させることが知られていることから、当該研究の進展に向けて、光依存的構造変化の検出系の確立に尽力した。検出にはタンパク質をトリプシンで処理したときのバンドパターンが立体構造の違いによって変化することを利用し、また精製方法も新たに改善した。これにより、暗状態と明状態の構造を明確に区別することが可能になった。当初はAt64とDmCRYの配列類似性に立脚して、DmCRYの変異体を作製し、DmCRYの構造変化機構を同定する予定であった。しかし、At64の電荷分離状態安定化機構が当初の予想よりもずっと特異的なものであったため、この方針の適用には至っていない。しかし、検出系の確立に成功していることから、今後、他の変異体を用いて実験することで、研究が進展すると期待される。

在这项研究中，我们重点研究了光复活酶/隐花色素超家族的功能控制机制，这是一个参与基因组稳态和昼夜节律形成的蓝光受体蛋白家族。我们特别关注两种蛋白质：来自拟南芥的 (6-4) 光激活酶 (At64) 和来自果蝇的隐花色素 (DmCRY)。已知两者都以光依赖性方式在辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和色氨酸残基之间形成电荷分离状态，然后还原FAD。这种光依赖性还原反应被认为控制着该蛋白质家族的各种功能。通过这个研究项目，申请人发现At64产生了异常稳定的电荷分离态，并结合光谱测量（包括纳秒量级的时间分辨测量）和分子动力学计算来研究稳定机制。新阐明了这个问题并在论文中报告了它。另一方面，由于已知 DmCRY 会随着光依赖性结构变化而改变其三级结构，因此我们努力建立光依赖性结构变化的检测系统，以推进这项研究。在检测中，我们利用了蛋白质在胰蛋白酶处理时由于其三维结构的差异而导致条带图案发生变化的事实，并且我们还新改进了纯化方法。这使得可以清楚地区分黑暗和明亮状态下的结构。最初，基于At64和DmCRY之间的序列相似性，我们计划创建DmCRY突变体并鉴定DmCRY的结构变化机制。然而，这一政策并未得到应用，因​​为稳定At64电荷分离状态的机制比最初预期的要具体得多。然而，由于检测系统已经成功建立，预计未来研究将通过使用其他突变体进行实验来取得进展。

项目成果

Universite Paris-Saclay/CEA/CNRS(フランス)

巴黎萨克雷大学/CEA/CNRS（法国）

Philipps-University Marburg(ドイツ)

马尔堡菲利普斯大学（德国）

Thermodynamic and kinetic factors affecting the redox chemistry of a flavin cofactor in photolyases

影响光裂合酶中黄素辅因子氧化还原化学的热力学和动力学因素

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuhei Hosokawa

Quantitative measurements of the redox chemistry of a flavin cofactor in photolyases and cryptochromes

光裂合酶和隐花色素中黄素辅因子氧化还原化学的定量测量

• 发表时间: 2021
• 作者: 細川雄平;盛田宏義;中村麻愛;岩井成憲;山元淳平
• 通讯作者: 山元淳平

台湾/中央研究院(その他の国・地域)

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