細胞外膜小胞への新奇タンパク質輸送機構の解明と応用

细胞外膜囊泡新型蛋白质转运机制的阐明和应用

基本信息

批准号：
21J13113
负责人：
釜阪紘平
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Shewanella vesiculosa HM13 は約 49 kDa のタンパク質 P49 を主要な積荷とする細胞外膜小胞 (EMV) を生産する。P49 はEMV による新奇タンパク質生産系の開発のためのキャリアとして期待されている。前年度までの研究によって、P49 は II 型輸送装置様分泌装置の働きによって細胞内から汲み出され、その後 Wzx 依存的に合成される EMV の莢膜多糖成分と相互作用することで EMV へと輸送されることが分かった。しかし、依然として生理機能、構造など基本的な情報が不足していることと、融合タンパク質の生産系の構築が難航していることが課題であった。P49 の C末端領域へ変異を導入する試みによって、C 末領域は P49 の EMV 中での発現に重要であることが判明したが、タグや異種タンパク質の導入に適した部位の特定には至っていない。このためには、X 線結晶構造解析による構造情報の取得が重要である。そこで、 P49 の結晶化条件のスクリーニングを実施した。結果、精製 P49 を再現性良く結晶化する条件を発見するに至った。現在、本結晶を用いて、重原子置換法による位相決定が進行中である。同時に、P49 の生理機能についても解析を進めた。結果、P49 は EMV のゼータ電位の絶対値を上昇させ、EMV 同士の静電的な反発が強め、EMV の分散性を向上させる機能を持つことが分かった。この分散性の上昇によって、EMV の表面積が増加し、EMV と細菌細胞との相互作用が促進されると考えられた。本研究によって、P49 の EMV への輸送機構や生理機能が明らかとなり、構造解析への道も拓かれた。融合タンパク質の発現やP49 へのタグ導入に関しては現状難航しているものの、今後の発展の基礎になる成果が得られたと考える。

Shewanella vesiculosa HM13 产生细胞外膜囊泡 (EMV)，其主要货物是大约 49 kDa 的蛋白质 P49。 P49有望成为利用EMV开发新型蛋白质生产系统的载体。去年进行的研究表明，P49 通过 II 型转运蛋白样分泌装置的作用从细胞中泵出，然后通过与 EMV 的荚膜多糖成分相互作用而转运至 EMV，该成分是在 Wzx- 中合成的。我发现它会发生。但由于缺乏生理功能、结构等基础信息，融合蛋白生产体系构建困难，仍存在问题。将突变引入 P49 的 C 端区域的尝试表明，C 端区域对于 P49 在 EMV 中的表达很重要，但尚未确定适合引入标签或外源蛋白的位点。为此，通过 X 射线晶体学获取结构信息非常重要。因此，我们对P49结晶条件进行了筛选。结果，我们发现了具有良好重现性的纯化 P49 结晶条件。目前正在使用该晶体利用重原子取代法进行相测定。同时，我们还分析了P49的生理功能。结果表明，P49具有增加EMV的zeta电位绝对值、加强EMV之间的静电斥力、提高EMV的分散性的作用。这种分散性的增加被认为可以增加 EMV 的表面积并促进 EMV 与细菌细胞之间的相互作用。该研究阐明了P49对EMV的转运机制和生理功能，也为结构分析奠定了基础。尽管目前在表达融合蛋白和将标签引入P49方面存在困难，但我们相信我们已经获得的结果将为未来的发展奠定基础。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Shewanella vesiculosa HM13 由来細胞外膜小胞への新奇タンパク質輸送機構に関する研究

水泡希瓦氏菌 HM13 细胞外膜囊泡蛋白质转运新机制的研究

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
釜阪紘平; 都築大空;川本純; 今井友也; 小川拓哉; 栗原達夫
通讯作者：
栗原達夫

Polysaccharide corona: The acetyl-rich envelope wraps the extracellular membrane vesicles and the cells of Shewanella vesiculosa providing adhesiveness

多糖冠：富含乙酰基的包膜包裹细胞外膜囊泡和泡状希瓦氏菌细胞，提供粘附性

DOI：
10.1016/j.carbpol.2022.120036
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
11.2
作者：
Casillo Angela;Di Guida Rossella;Cavasso Domenico;Stellavato Antonietta;Rai Diksha;Yokoyama Fumiaki;Kamasaka Kouhei;Kawamoto Jun;Kurihara Tatsuo;Schiraldi Chiara;Kulkarni Suvarn;Paduano Luigi;Corsaro Maria Michela
通讯作者：
Corsaro Maria Michela

Polysaccharide corona: The acetyl-rich envelope wraps the extracellular membrane vesicles and the cells of Shewanella vesiculosa providing adhesiveness

多糖冠：富含乙酰基的包膜包裹细胞外膜囊泡和泡状希瓦氏菌细胞，提供粘附性

DOI：
10.1016/j.carbpol.2022.120036
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
11.2
作者：
Casillo Angela;Di Guida Rossella;Cavasso Domenico;Stellavato Antonietta;Rai Diksha;Yokoyama Fumiaki;Kamasaka Kouhei;Kawamoto Jun;Kurihara Tatsuo;Schiraldi Chiara;Kulkarni Suvarn;Paduano Luigi;Corsaro Maria Michela
通讯作者：
Corsaro Maria Michela

Shewanella vesiculosa HM13由来細胞外膜小胞表層タンパク質の生理機能解析

泡状希瓦氏菌HM13细胞外膜囊泡表面蛋白的生理功能分析