フローサイトメトリーを利用した腎線維化機序の解明

使用流式细胞术阐明肾纤维化机制

• 批准号: 21K08246
• 负责人: 廣村 桂樹
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08246/
• 关键词: 腎臓病学; 尿細管障害; 筋線維芽細胞; 腎線維化; 腎不全; 尿細管間質障害; フローサイトメトリー

本研究はフローサイトメトリー（FCM）を用いて腎線維化の機序を解明するものである。これまでの検討では、片側尿管結紮（UUO）を施したマウスの腎臓細胞をFCMで解析し、UUO後14日頃をピークにαSMA陽性細胞が増加し、αSMAとPDGFRβの間に強い相関があることを見出した。これにより、PDGFRβが筋線維芽細胞の適切なマーカーであると考えられた。そこで、今年度はPDGFRβをマーカーとして、UUOマウスの腎臓からFCMでPDGFRβ陽性細胞を単離した。また、UUOマウスの腎臓で増加が見られたF4/80陽性細胞も単離し、両細胞の比較を行った。FCMの条件を調整することで、それぞれの細胞を約90%の純度でソートできた。Western blotでの解析では、PDGFRβ陽性細胞からはコラーゲン1の発現が確認できたが、F4/80陽性細胞からは確認できなかった。続いて、PDGFRβ陽性細胞とF4/80陽性細胞からそれぞれmRNAを抽出し、線維化や炎症細胞の遊走、分化に関連する分子についてqPCRにより検討した。PDGFRβ陽性細胞ではcol1a、Acta2、IL1r1、CX3CL1のmRNAの上昇を確認した。一方、F4/80陽性細胞ではPDGFb、IL-1β, Ccr2, Ccr5, Ccl2, Ccl3, CX3CR1の発現が亢進していた。これらの結果から、PDGFRβ陽性細胞の一部が筋線維芽細胞となり、一方、F4/80陽性細胞はPDGFを産生するとともに様々なサイトカインやケモカインを産生して炎症や線維化の促進に関与している可能性が示唆された。

本研究使用流式细胞术（FCM）来阐明肾纤维化的机制。在之前的研究中，使用FCM对接受单侧输尿管结扎（UUO）的小鼠的肾细胞进行分析，发现αSMA阳性细胞在UUO后14天左右达到峰值，并且发现αSMA和PDGFRβ之间存在很强的相关性。 。这表明 PDGFRβ 是肌成纤维细胞的合适标记物。因此，今年，我们使用FCM从UUO小鼠的肾脏中分离出PDGFRβ阳性细胞，并以PDGFRβ为标记。我们还分离了 F4/80 阳性细胞，观察到这些细胞在 UUO 小鼠的肾脏中增加，并比较了两种类型的细胞。通过调整 FCM 条件，我们能够以大约 90% 的纯度对每个细胞进行分选。 Western blot 分析证实了 PDGFRβ 阳性细胞中胶原蛋白 1 的表达，但 F4/80 阳性细胞中不表达。接下来，从PDGFRβ阳性细胞和F4/80阳性细胞中提取mRNA，并使用qPCR检查与纤维化、炎症细胞迁移和分化相关的分子。 PDGFRβ 阳性细胞中 col1a、Acta2、IL1r1 和 CX3CL1 的 mRNA 水平增加。另一方面，F4/80阳性细胞中PDGFb、IL-1β、Ccr2、Ccr5、Ccl2、Ccl3和CX3CR1的表达增加。这些结果表明，一些PDGFRβ阳性细胞变成肌成纤维细胞，而F4/80阳性细胞产生PDGF以及各种细胞因子和趋化因子，并参与促进炎症和纤维化。

项目成果

腎線維化における筋線維芽細胞のフローサイトメトリーによる検討

肌成纤维细胞在肾纤维化中的流式细胞术研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 諏訪絢也;金子和光;渡辺光治;今井陽一;Shreya Shrestha;木下雅人;大石裕子;中里見征央;浜谷博子;坂入徹;池内秀和;廣村桂樹
• 通讯作者: 廣村桂樹