細胞外ミトコンドリア放出を伝達ツールとした心不全病態悪化の検討及び治療への応用

心力衰竭病理学恶化的检查及其在使用细胞外线粒体释放作为传输工具的治疗中的应用

基本信息

批准号：
21K08141
负责人：
小原幸
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Kyoto Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、新生仔ラット培養心筋細胞からの細胞外ミトコンドリア放出と放出ミトコンドリアの障害について検討した。新生仔ラット培養心筋細胞に低酸素再酸素化(H/R)刺激を行い、培養上清を回収した。培養上清中へのミトコンドリア単体放出、あるいはエキソソーム放出を検出する目的で、MitoView green染色DiI染色を各々行った。共焦点レーザー顕微鏡で蛍光染色の確認を行ったところ、MitoView green陽性ミトコンドリア放出は認めたが、DiI陽性小粒子はほとんど認めなかった。心筋細胞への刺激条件や、染色条件を変えて検討したが、いずれも明らかなDiI陽性小粒子は認められなかった。従って、低酸素再酸素化条件では単体としてミトコンドリア放出が主だと考えられた。ミトコンドリア蛍光プローブ以外にも、培養上清中のミトコンドリア放出をミトコンドリア特異タンパクであるTom20のWesternblot法で確認した。H/R刺激後の培養上清においてTom20タンパクの含有量増加が認められた。H/R刺激後の培養上清より遠心分離法で放出ミトコンドリアの分画を得て、新たな培養心筋細胞上清に加えたところ、軽度ではあるが細胞壊死を導き自己心拍のレートの減少が認められ、心筋細胞に対する障害性が観察された。また、新生仔ラット培養心筋細胞において、H/R刺激による障害に対するホノキオールの保護効果を検討した。ホノキオール投与は心筋H/R障害に伴う細胞壊死やアポトーシス細胞死を軽減していた。ホノキオールはH/R刺激に伴う心筋細胞内酸化ストレス増強を軽減していた。その機序にミトコンドリアSIRT3の保持によるSOD2脱アセチル化及び細胞内ATPの保持が認められた。さらに、本薬剤の投与により細胞外ミトコンドリア放出も軽減されていた。

今年，我们研究了细胞外线粒体的释放，以及新生儿大鼠培养的心肌细胞释放的线粒体损坏。用缺氧（H/R）刺激新生大鼠培养的心肌细胞，并收集培养上清液。进行Mitoview绿色染色DII染色是为了检测单独的线粒体或外部释放到培养物上清液中的释放。当使用共聚焦激光显微镜确认荧光染色时，观察到mitoview绿色阳性线粒体释放，但发现很少的DII阳性颗粒。尽管刺激心肌细胞和染色的条件有所不同，但未发现明显的DII阳性小颗粒。因此，线粒体释放被认为是低氧抗氧化条件下的主要物质。除线粒体荧光探针外，培养上清液中的线粒体释放是通过线粒体特异性蛋白Tom20的WesternBlot方法证实的。 H/R刺激后，在培养物上清液中观察到TOM20蛋白的含量增加。通过离心H/R刺激H/R刺激后，释放的线粒体馏分是从培养物上清液中获得的，并将其添加到新的培养的心肌细胞上清液中，尽管观察到了轻度，但观察到细胞坏死，导致自beat速率降低，导致心肌细胞损伤。此外，我们研究了Honokiol对新生大鼠培养的心肌细胞中H/R刺激的保护作用。 Honokiol给药减少了与心肌H/R疾病相关的细胞坏死和凋亡细胞死亡。 Honokiol降低了与H/R刺激相关的心脏内膜细胞氧化应激的增加。观察到通过保持线粒体SIRT3和保留细胞内ATP的SOD2脱乙酰化的机制。此外，该药物的给药还减少了细胞外线粒体释放。