Development of novel gene therapy for MELAS by editing mitochondorial DNA

通过编辑线粒体 DNA 开发针对 MELAS 的新型基因疗法

基本信息

批准号：
21K07782
负责人：
秦龍二
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07782/
关键词：
MELAS ミトコンドリア病ゲノム編集 TALEN iPS gene editing

项目摘要

ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(= MELAS) は母系遺伝をするミトコンドリア病の一つで、mtDNAのA3243G, A3252G, G13513A等の点変異が原因で発症することが知られている。MELASの発症時期や重篤度なども多様であり、その複雑な臨床像を反映する病態メカニズムは推測の域を出ておらず、確立された治療法は存在していない。本研究は、MELAS患者由来iPS細胞とMELASモデルマウス(Mito-mice)を用いて、その病態機構の解明と革新的な遺伝子治療法の開発を目的としている。前年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）に対するTALEN pairsの作成を行った。最初にSSA assayにより幾つかのTALEN pairの候補を見いだした。その後このmito-miceの作成に利用された変異mtDNA（A2748G変異）を有するmouse ES cellで同様に検討し更に候補を絞った。1)N末端側のTALEを1塩基変異させて、その特異性を上げる。2)発現ベクターのコドンを改変する。といった工夫を行い、これにより最終的にheteroplasmyが80％あったmouse ES cellにTALEN pairsをtranfectしてやると。30％まで軽減させることができ、大変効率の良いTALEN pairの作成に成功した。本年度はこの効率の良いTALEN pairsを発現するAAVベクター（mit-TALEN-AAV）の作成を行い。既に完了した。現在このmit-TALEN-AAVを現在mit-A2748G-miceの大腿四頭筋に筋肉注射し、骨格筋でのheteroplasmyを改善できるかどうかを検討している。

线粒体脑肌病/乳酸性酸中毒/中风样发作综合征（MELAS）是一种母系遗传的线粒体疾病，已知由线粒体 DNA 中的点突变（例如 A3243G、A3252G 和 G13513A）引起。 MELAS 的发病时间和严重程度各不相同，反映其复杂临床情况的病理机制仍处于推测状态，并且尚无既定的治疗方法。本研究旨在利用MELAS患者来源的iPS细胞和MELAS模型小鼠（Mito-mice）阐明其病理机制并开发创新的基因治疗方法。去年，我们为有丝分裂小鼠（mit-A2748G-mice）创建了 TALEN 对，该小鼠的线粒体 DNA 中存在 A2748G 突变。首先，我们通过 SSA 测定发现了几个 TALEN 对候选者。随后，我们使用含有用于创建有丝分裂小鼠的突变mtDNA（A2748G突变）的小鼠ES细胞进行了类似的研究，并进一步缩小了候选范围。 1) N端TALE中一个碱基的突变增加了其特异性。 2) 修改表达载体的密码子。通过这样做，我们最终将 TALEN 对转染到具有 80% 异质性的小鼠 ES 细胞中。我们能够将这种情况减少高达 30%，并成功创建了高效的 TALEN 对。今年，我们将创建一个 AAV 载体 (mit-TALEN-AAV) 来表达这些有效的 TALEN 对。已经完成了。我们目前正在将这种 mit-TALEN-AAV 肌肉注射到 mit-A2748G 小鼠的股四头肌中，以研究它是否可以改善骨骼肌的异质性。