標的ゲノム編集/系統的ノックダウンによる染色体転座頻度を増加させる因子の探索

通过靶向基因组编辑/系统性敲低寻找增加染色体易位频率的因素

• 批准号: 21K07681
• 负责人: 津山 尚宏
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07681/
• 关键词: 染色体転座; 電離放射線; CRISPR-Cas9; 放射線感受性; 責任遺伝子; CRISPR/Cas9

電離放射線はDNA二本鎖切断を介して細胞ゲノムに転座などのランダムな染色体異常を誘発し、異常頻度は線量依存的に増加する。DNA二本鎖切断修復の過程で、異なる切断末端同士が再結合して染色体異常（転座）が生じる分子機構の全体像は不明である。また特定の染色体転座は疾病の原因となるため、染色体転座を調節する機構の解明は重要である。本研究ではまず、正常ヒト集団の自然に生じる染色体転座頻度と放射線によって誘導される染色体転座頻度の基礎データを得るため、インフォームドコンセントを得た若い健常人の末梢血リンパ球を単離し、自然に生じた染色体転座頻度および放射線照射により誘発された転座頻度を解析している。同時に培養細胞を用いて染色体転座の分子機構解析を行っている。CRISPR-Cas9を用いたt(11;14)転座誘導系に加えt(11;22), t(5;6)転座誘導系を作成し、導入した培養細胞の転座頻度をリアルタイムPCRでモニターする。導入する細胞には、予め、DNA二本鎖切断(DSB)修復シグナル・ゲノム不安定性、放射線感受性を修飾する責任遺伝子、代謝やレドックス制御シグナル分子群について、特異的阻害剤処理やレトロウイルスshRNA発現ベクターによる系統的なノックダウンを行い、転座頻度の変化を観察する。さらにゲノム編集を用いて作製したATMなどの既知遺伝子異常のヘテロ接合細胞を用いた転座誘導影響解析を行う。加えて、未知の機序解明のため全ゲノムCRISPR-Cas9ノックアウトライブラリー導入による易転座誘発性の獲得と標的同定を行い、染色体転座誘発機序の理解を目指す。

电离辐射可引起随机染色体异常，例如通过DNA双链断裂转移到细胞基因组中，异常频率以剂量依赖性方式增加。在DNA双链破裂修复过程中不同裂解终止重组的分子机制的总体图，导致染色体异常（易位）。此外，由于特定的染色体易位会导致疾病，因此阐明调节染色体易位的机制很重要。在这项研究中，我们首先分析了正常人种群中天然存在的染色体易位频率和辐射诱导的染色体易位频率。分离出已获得知情同意的年轻健康个体的外周血淋巴细胞被分离出来，并分析了天然存在的染色体易位频率和辐射诱导的易位频率。同时，使用培养细胞分析染色体易位的分子机制。除了使用CRISPR-CAS9，T（11; 22），t（5; 6）易位感应系统的T（11; 14）易位感应系统外，还通过实时PCR监视了引入的培养细胞中易位的易位频率。要引入的细胞受到特定的抑制剂治疗，并系统地敲低负责修饰DNA双链断裂（DSB）修复信号，基因组不稳定性，辐射敏感性以及代谢和氧化还原信号分子的组，并使用递离病毒shRNA表达源观察转移频率的变化。此外，使用已知基因异常的杂合细胞（例如使用基因组编辑产生的ATM）进行易位诱导效应分析。此外，为了阐明未知机制，我们通过引入整个基因组CRISPR-CAS9敲除库来获得易于转运的诱导并识别目标，并旨在了解染色体易位诱导的机制。

项目成果

Analysis of differential gene expression in t(11;14) carrying iPS cells induced by genome editing

基因组编辑诱导的t(11;14)携带iPS细胞差异基因表达分析

• 发表时间: 2022
• 作者: Naohiro Tsuyama;Kenichi Kudo;Misaki Sugai Takahashi;Yusuke Azami;Kenji Kamiya;Akira Sakai.
• 通讯作者: Akira Sakai.

Optimization of chromosome specimen preparation for biodosimetry using chromosome aberration frequency.

使用染色体畸变频率优化用于生物剂量测定的染色体样本制备。

• 发表时间: 2021
• 作者: Naohiro Tsuyama;Yu Abe;Misaki Sugai-Takahashi;Kenichi Kudo;Yusuke Azami;Miwa Fukami;Tomisato Miura;Kenji Kamiya;Akira Sakai
• 通讯作者: Akira Sakai

Analysis of differential gene expression in t(11;14) carrying iPS cells induced by genome editing and Cre-loxP.

基因组编辑和 Cre-loxP 诱导的 t(11;14) 携带 iPS 细胞差异基因表达分析。

• 发表时间: 2023
• 作者: Naohiro Tsuyama;Yu Abe;Misaki Sugai Takahashi;Kenji Kamiya;Akira Sakai
• 通讯作者: Akira Sakai

Study for exploring myeloma-initiating cell using normal B cell-derived iPS cells.

使用正常 B 细胞衍生的 iPS 细胞探索骨髓瘤起始细胞的研究。

• 发表时间: 2021
• 作者: Yusuke Azami;Naohiro Tsuyama;Yu Abe;Misaki Sugai-Takahashi;Ken-ichi Kudo;Miwa Fukami;Akinobu Ota;Karnan Sivasundaram;Moe Muramatsu;Tomonari Shigemura;Megumi Sasatani;Yuko Hashimoto;Shigehira Saji;Kenji Kamiya;Ichiro Hanamura;Takayuki Ikezoe
• 通讯作者: Takayuki Ikezoe