THIKチャネル遠位C末端領域によるゲート制御機構の分子基盤の解明

阐明 THIK 通道远端 C 端区域门控机制的分子基础

• 批准号: 21K06793
• 负责人: 立山 充博
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute for Physiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06793/
• 关键词: カリウムチャネル; K2P; THIK-1; Gタンパク質共役型受容体; ゲーティング; THIKチャネル; 光クロスリンク反応; 光クロスリンク; カリウムチャネル; K2P; THIK-1; Gタンパク質共役型受容体; ゲーティング; THIKチャネル; 光クロスリンク反応; 光クロスリンク

本研究は、「THIKチャネル遠位C末端領域によるゲート制御機構の分子基盤の解明」を目的としたものであり、前年度に、チャネル活性化に伴い膜貫通部位で構造変化が起こることを示唆する結果を得た。本年度も、膜貫通部位における構造変化に関する研究を継続し、新たな知見を得た。紫外線照射によりN=N=N基が活性化し数Å以内の原子と不可逆的に反応する光クロスリンクアミノ酸 4-azido-phenylalanine （4AzP）を THIK-1チャネルの第2膜貫通部位に位置するアミノ酸残基に導入し、機能解析を行った。コンストラクトの多くはGq共役型受容体刺激による電流増加を示したが、L146に4AzPを導入した場合は電流増加が見られなかった。さらに、紫外線照射を行ったところ、多くのコンストラクトで電流増加が確認されたが、F145およびL146へ導入した場合は、電流減少が見られた。これらの結果は、紫外線照射による光クロス反応もしくは窒素分子の解離により、チャネル膜貫通部位に構造変化が生じたことを示唆する。紫外線照射後は、I139およびL140に4AzPを導入したチャネルにおいてGq共役型受容体刺激による電流増加が消失していた。これは、光クロス反応によりチャネル構造が固定化され、Gq応答により起こるべき構造変化が阻害されたためであると考えられた。即ち、Gq刺激により膜貫通部位に構造変化が生じて電流が増加するというモデルを支持する結果が得られた。一方、計画していた生化学的実験では、ウェスタンブロットにおける、複数のバンドの検出および分子量の不一致などの問題を解決するに至らなかった。全体としては、機能解析を中心に、一定の成果を得ることができ、おおむね順調に研究は進んでいるといえる。

这项研究旨在“通过THIK通道的远端C末端区域阐明栅极控制机理的分子基础”，在上一年，我们获得了结果，这表明由于通道激活而导致跨膜位点发生结构变化。今年，我们继续研究跨膜站点的结构变化，获得了新的发现。光链接的氨基酸4-氮杂 - 苯基丙氨酸（4AZP），该氨基酸激活n = n = n组，并通过紫外线辐射在几个Å中与原子不可逆地反应，并在位于位于thik-1通道的第二个跨膜位点的氨基酸残留物中引入了氨基酸残基，并进行了功能分析。由于GQ结合受体刺激，许多构建体显示电流增加，但是当将4AZP引入L146中时，电流未观察到电流的增加。此外，当进行紫外线照射时，在许多构建体中观察到电流的增加，但是当引入F145和L146时，观察到电流的降低。这些结果表明，由于紫外线辐射或氮分子解离引起的光叠骨反应导致跨膜位点的结构变化。紫外线照射后，在将4AZP引入I139和L140的通道中消除了由GQ共轭受体刺激引起的电流的增加。这被认为是因为通道结构被光叠乳反应固定，并且应发生的结构变化受到GQ响应的抑制。也就是说，得到的结果支持了由于GQ刺激和电流增加而在跨膜部位发生结构变化的模型。另一方面，计划的生化实验无法解决问题，例如检测多个带和分子量的蛋白质印迹中的分子量不匹配。总体而言，我们已经取得了某些结果，重点是功能分析，可以说研究的进展总体顺利。