THIKチャネル遠位C末端領域によるゲート制御機構の分子基盤の解明

阐明 THIK 通道远端 C 端区域门控机制的分子基础

基本信息

批准号：
21K06793
负责人：
立山充博
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、「THIKチャネル遠位C末端領域によるゲート制御機構の分子基盤の解明」を目的としたものであり、前年度に、チャネル活性化に伴い膜貫通部位で構造変化が起こることを示唆する結果を得た。本年度も、膜貫通部位における構造変化に関する研究を継続し、新たな知見を得た。紫外線照射によりN=N=N基が活性化し数Å以内の原子と不可逆的に反応する光クロスリンクアミノ酸 4-azido-phenylalanine （4AzP）を THIK-1チャネルの第2膜貫通部位に位置するアミノ酸残基に導入し、機能解析を行った。コンストラクトの多くはGq共役型受容体刺激による電流増加を示したが、L146に4AzPを導入した場合は電流増加が見られなかった。さらに、紫外線照射を行ったところ、多くのコンストラクトで電流増加が確認されたが、F145およびL146へ導入した場合は、電流減少が見られた。これらの結果は、紫外線照射による光クロス反応もしくは窒素分子の解離により、チャネル膜貫通部位に構造変化が生じたことを示唆する。紫外線照射後は、I139およびL140に4AzPを導入したチャネルにおいてGq共役型受容体刺激による電流増加が消失していた。これは、光クロス反応によりチャネル構造が固定化され、Gq応答により起こるべき構造変化が阻害されたためであると考えられた。即ち、Gq刺激により膜貫通部位に構造変化が生じて電流が増加するというモデルを支持する結果が得られた。一方、計画していた生化学的実験では、ウェスタンブロットにおける、複数のバンドの検出および分子量の不一致などの問題を解決するに至らなかった。全体としては、機能解析を中心に、一定の成果を得ることができ、おおむね順調に研究は進んでいるといえる。

这项研究的目的是“阐明THIK通道远端C端区域的门控制机制的分子基础”，并在前一年提出，通道激活后跨膜位点会发生结构变化。得到结果了。今年，我们继续研究跨膜位点的结构变化，并获得了新的发现。 4-叠氮基-苯丙氨酸 (4AzP) 是一种光交联氨基酸，其 N=N=N 基团在紫外线照射下被激活，并与几埃内的原子发生不可逆反应，是位于 THIK-1 第二跨膜位点的氨基酸通道被引入残留物中并进行功能分析。大多数构建体在刺激 Gq 偶联受体后显示出电流增加，但当将 4AzP 引入 L146 时没有观察到电流增加。此外，当进行UV照射时，在许多构建体中观察到电流增加，但是当引入F145和L146时观察到电流减少。这些结果表明，由于紫外线照射导致的光交叉反应或氮分子解离，在通道跨膜位点发生了结构变化。 UV照射后，在将4AzP引入I139和L140的通道中，由Gq偶联受体刺激引起的电流增加消失。这被认为是因为通道结构被光交叉反应固定，抑制了由于 Gq 响应而发生的结构变化。换句话说，结果支持这样的模型：Gq 刺激引起跨膜位点的结构变化，从而导致电流增加。另一方面，计划中的生化实验并没有解决Western blot中多条带检测、分子量不匹配等问题。总体来看，我们能够取得一定水平的成果，主要是泛函分析方面，可以说研究进展总体顺利。