Investigating the crosstalk between angiogenesis and neurogenesis: elucidating the mechanism of cerebrovascular morphogenesis

研究血管生成和神经发生之间的串扰：阐明脑血管形态发生的机制

基本信息

批准号：
21K06740
负责人：
木村英二
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Iwate Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06740/
关键词：
血管形成ゼブラフィッシュ CRISPR/Cas9 ゲノム編集神経発生脳血管 CRISPR

项目摘要

本研究では、小型魚類のゼブラフィッシュを材料とし、脳血管系の形成過程における神経発生の関与、血管形成と神経発生のクロストークの解明を目的とする。そのために神経発生過程における遺伝子の発現パターンを脳血管系の形成過程と照らし合わせることで、関連が想起される発現パターンを示す遺伝子群を選定した。これらの標的遺伝子群を近年急速に普及しているゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を用いてノックアウトし、脳血管系の形態形成への影響を評価する。また魚類では進化の早い段階でゲノムの倍化が生じており、パラログ遺伝子により機能が補完されている可能性が想定される。パラログ遺伝子を同時にノックアウトすることで確実に表現型を示す系統を作成し解析を進める。2021年度には、対象遺伝子を再確認し、それら全てのsgRNAを合成し、受精卵へ一通りインジェクションしゲノム活性評価を実施するところまで進捗した。しかしながら約半数ではゲノム編集活性を確認することができなかったため、2022年度には改めて残りの遺伝子群のゲノム編集活性を有するsgRNAの合成を試みた。しかしながら多くの遺伝子群では、この段階でも活性を認めなかったため、残りの研究期間との兼ね合いも考慮しIDTによるcrRNAの導入を行った。crRNAではtracrRNAと合わせてインジェクションすることでsgRNAと同等以上のゲノム編集が可能となる。またこの導入によりsgRNAの作成に時間を取られることなく研究を進めていくことが可能となり、その結果予定した遺伝子群でゲノム編集能を有するsgRNAをすべて取得することができた。2022年度内で全ての対象遺伝子に対するsgRNAのインジェクションを終わらせており、今後F0世代が成長した段階で順次potential founderの同定を行い破壊体の系統樹立を目指していく。

在本研究中，我们旨在以小鱼斑马鱼为材料，阐明神经发生在脑血管形成过程中的参与以及血管发生和神经发生之间的串扰。为此，通过比较神经发育过程和脑血管系统形成过程中的基因表达模式，我们选择了一组表现出暗示关系的表达模式的基因。我们将利用近年来迅速流行的基因组编辑技术CRISPR/Cas9敲除这些靶基因，并评估它们对脑血管形态发生的影响。此外，在鱼类中，基因组加倍发生在进化的早期阶段，并且假设功能可能由旁系同源基因补充。通过同时敲除旁系同源基因，我们将创建能够可靠地表现出表型的品系并继续进行分析。 2021年，我们重新确认了目标基因，合成了所有的sgRNA，并取得了进展，将它们注射到受精卵中并进行基因组活性评估。然而，由于大约一半的基因无法证实基因组编辑活性，因此我们在2022年尝试为其余基因组合成具有基因组编辑活性的sgRNA。然而，在许多基因组中，即使在这个阶段也没有观察到活性，因此考虑到剩余的研究时间，使用IDT引入了crRNA。当crRNA与tracrRNA一起注射时，可以进行与sgRNA相当或更好的基因组编辑。这一介绍也使得研究得以继续进行，而无需浪费时间创建 sgRNA，因此，我们能够获得针对计划基因组的所有具有基因组编辑能力的 sgRNA。我们将在2022年底完成所有目标基因的sgRNA注入，随着F0代的成长，我们将依次识别潜在的创始人，旨在建立一个被破坏的谱系。