The interrelationship between oligomer formation, DNA unwinding, and ATPase of a helicase studied using mutants lacking its C-terminal amino acids

使用缺乏 C 末端氨基酸的突变体研究低聚物形成、DNA 解旋和解旋酶 ATP 酶之间的相互关系

基本信息

批准号：
21K06103
负责人：
横田浩章
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06103/
关键词：
１分子計測ナノバイオ核酸酵素反応 1分子計測ヘリカーゼ

项目摘要

多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD のC末端アミノ酸欠失変異体が、野生型に比べて多量体を形成しづらいことを明らかにした。一方、その多量体構造は報告されておらず、多量体を構成する個々のUvrDがどのような相互作用を経て、ATP加水分解エネルギーを使いDNA巻き戻しをしているのかは不明である。そこで本研究ではUvrDのDNA巻き戻し機能に関わる多量体形成に重要なC末端アミノ酸に注目し、UvrDの多量体構造・DNA巻き戻し機能・ATPの結合解離（ATPase）の相関関係を蛍光1分子イメージングで明らかにする。そしてこれまで明らかにするのが困難だったタンパク質の多量体形成とそれによる機能発現の間のブラックボックスに迫ることを目指している。研究代表者は、多量体を形成できないとされるC末端40アミノ酸欠損変異体（UvrDΔ40C）が定説に反し、二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている（Biophysical Journal (2020)、生物物理 (2021)、Biophysics and Physicobiology (2022)）。2022年度は、UvrD のC末端アミノ酸の多量体形成への役割をさらに理解するために、ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の解析を進め、UvrD－DNA間の結合・解離速度定数を得た。また、UvrDのサブドメインの特定サイトの特異的蛍光標識、UvrD多量体構造の蛍光1分子イメージング、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察に取り組んだ。

在许多蛋白质中观察到的多聚体形成在调节蛋白质活性中起着重要作用。主要研究人员发现，非六聚体超家族 1 解旋酶 UvrD 的 C 端氨基酸缺失突变体形成多聚体的能力低于野生型。另一方面，多聚体结构尚未被报道，并且尚不清楚组成多聚体的各个 UvrD 如何相互作用以利用 ATP 水解能量解开 DNA。因此，在本研究中，我们重点关注与UvrD的DNA解旋功能相关的多聚体形成中重要的C端氨基酸，并研究了UvrD的多聚体结构、DNA解旋功能以及结合和结合之间的相关性。通过成像揭示单个荧光分子中 ATP（ATP 酶）的解离。我们的目标是接近蛋白质多聚化和由此产生的功能表达之间的黑匣子，迄今为止这一直很难阐明。主要研究人员发现，C 端 40 个氨基酸缺失突变体 (UvrDΔ40C) 据说无法形成多聚体，会将 DNA 解旋为二聚体或三聚体，这与既定理论相反（《生物物理学杂志》(2020)，《生物物理学》) 2021），生物物理学和物理生物学（2022））。 2022年，为了进一步了解UvrD C端氨基酸在多聚化中的作用，我们将开发DNA包裹突变体，其中解旋酶超家族保守亚结构域之外的所有C端氨基酸都被删除。分析回复过程并获得UvrD与DNA之间的结合和解离速率常数。我们还对 UvrD 子域中的特定位点进行特异性荧光标记，UvrD 多聚体结构的单分子荧光成像，使用零模波导在高浓度荧光 ATP 条件下进行单分子荧光成像，以及 DNA 解旋的单碱基分辨率。我进行了观察。