細胞核構造によるゲノム安定化と老化抑制の機構解明

通过细胞核结构阐明基因组稳定和衰老抑制机制

• 批准号: 21K05497
• 负责人: 堀籠 智洋
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05497/
• 关键词: リボソームRNA遺伝子; rDNA; 核膜; 老化; 若返り; マイクロ流体チップ

課題1　核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明：　2022年度には、リボソームRNA遺伝子（rDNA）においてDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成と核膜の位置関係を、顕微鏡を用いて定量解析した。解析では、rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた。通常、DNA複製後のDNA二本鎖切断部位は、コヒージョンにより1つの赤色蛍光輝点として観察されるが、コヒージョンに欠陥がある細胞では2点として観察される。コヒージョンが確立した細胞（輝点１つ）では、コヒージョンが確立していない細胞（輝点2つ）の細胞と比べて切断部位が核膜に近接している傾向があることが分かった。核膜結合によるrDNA安定化の作用点を遺伝学的に同定するため、fob1 nup120二重破壊株を構築した。現在sir2 nup120二重破壊株を作製しており、完成後、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。課題2　老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析：　野生株の酵母細胞をビオチン標識した後に分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞（平均３～4回出芽）を選別した。若い細胞と老化細胞においてMAT遺伝子座にHOエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断を誘導し、核膜とDNA二本鎖切断部位の位置関係を定量的顕微鏡法により解析した。若い細胞と老化細胞いずれにおいても切断誘導前後にその領域が核膜に移動する現象が観察され、老化細胞であっても損傷DNAの核膜への移動は維持されていることが明らかになった。

主题一：阐明核膜结合在稳定rDNA和抑制细胞衰老中的作用：2022年，我们将研究核糖体RNA基因（rDNA）中诱导​​DNA双链断裂时，内聚形成与核膜的位置关系使用显微镜进行定量分析。在分析中，我们使用了在rDNA重复序列的一个位置引入了I-SceI切割位点和tetO序列的菌株，以及用半乳糖诱导I-SceI核酸内切酶表达的菌株，并且切割使用 TetI-mRFP 对位点进行可视化。通常，DNA复制后的DNA双链断裂位点由于凝聚力而被观察为单个红色荧光点，但在具有凝聚力缺陷的细胞中，其被观察为两个点。研究发现，在已建立内聚力的细胞中（一个亮点），裂解位点往往比未建立内聚力的细胞（两个亮点）更靠近核膜。为了通过核膜结合从遗传上鉴定 rDNA 稳定作用位点，我们构建了 fob1 nup120 双破坏菌株。我们目前正在创建 Sir2 nup120 双破坏菌株，一旦完成，我们将使用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 对 rDNA 稳定性进行遗传分析。作业2：分析衰老细胞核膜上的基因组稳定性：对野生型酵母细胞进行生物素标记后，选择细胞进行重复分裂。我们通过H2O核酸内切酶在年轻和衰老细胞的MAT位点诱导DNA双链断裂，并使用定量显微镜分析了核膜和DNA双链断裂位点之间的位置关系。在年轻细胞和衰老细胞中，都观察到该区域在诱导分裂之前和之后迁移至核膜的现象，这表明即使在衰老细胞中，受损的DNA向核膜的移动也得以维持。

项目成果

Analysis of the molecular evolution of histone variant H2A.Z using a linker-mediated complex strategy and yeast genetic complementation

使用连接子介导的复杂策略和酵母遗传互补分析组蛋白变体 H2A.Z 的分子进化

• DOI: 10.1093/bbb/zbab190
• 发表时间: 2021
• 期刊: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
• 作者: Kitagawa Saho;Kusakabe Masayuki;Takahashi Daisuke;Narimiya Takumi;Nakabayashi Yu;Seki Masayuki;Horigome Chihiro;Harata Masahiko
• 通讯作者: Harata Masahiko

DNA二本鎖切断部位の核膜結合がゲノム安定化に果たす役割

DNA 双链断裂的核膜结合在基因组稳定中的作用

• 发表时间: 2022
• 作者: 岡田大和;堀川和希;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋

DNA損傷誘導性姉妹染色分体間接着には損傷部位と核膜孔との結合が必要である

DNA 损伤诱导的姐妹染色单体粘附需要受损位点与核孔之间的结合。

• 发表时间: 2021
• 作者: 岡田大和;折原行希;高橋大輔;小西辰紀;尾間由佳子;島田健士;Susan M. Gasser;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋

東北大学大学院農学研究科・農学部 分子生物化学分野ウェブサイト

东北大学农学研究科/农学部分子生物化学系网站

老化した出芽酵母におけるDNA二本鎖切断の解析

老化酿酒酵母 DNA 双链断裂分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 堀川和希;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋