放射線抵抗性細菌のDNA損傷認知に基づくPprI依存的DNA損傷応答機構の解明

基于抗辐射细菌DNA损伤识别阐明PprI依赖性DNA损伤反应机制

基本信息

批准号：
21K05356
负责人：
佐藤勝也
金额：
$ 2.58万
依托单位：
National Institutes for Quantum Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスのDNA損傷応答機構において、PprIタンパク質は、DNA損傷に関係なく構成的な発現をしていることから、DNA損傷時に、PprIタンパク質を活性化する機構の存在が示唆される。PprIタンパク質は活性中心にMnを配位することでメタロプロテアーゼ活性を有する。そこで、PprIタンパク質の活性化に関連が示唆されるMnの細胞内への輸送及び細胞外への排出に関わるタンパク質をコードする遺伝子（DR1709及びDR2523）に着目し、これら遺伝子を破壊することで、DNA損傷応答機構への影響について解析を試みた。具体的には、DR1709及びDR2523遺伝子の上流及び下流の領域（800bp程度）をそれぞれPCR増幅した各DNA断片で、カナマイシン耐性遺伝子カセットを連結することで遺伝子破壊用DNA断片を作製した。得られたDNA断片を用いてラジオデュランスの野生株を形質転換し、2種のMn輸送欠損変異株を作製した。細胞内Mn蓄積量と増殖への影響を調査したところ、Mn輸送欠損によって、野生型よりも増殖に遅延がみられた。DR1709欠損変異株の増殖遅延は、細胞内へのMn輸送量の減少によると考えられた。一方、DR2523欠損変異株の増殖遅延は、細胞外へのMn排出の低下により細胞内Mn蓄積が過剰となり、増殖に遅延がみられたと考えられた。さらに、Mn輸送欠損株について、ガンマ線に対する感受性を測定した。その結果、2種のMn輸送欠損株はいずれも、野生型と比べて非常に感受性を示した。また、培地へのMn添加によって、野生株及びMn輸送欠損株いずれもガンマ線耐性の向上がみられた。しかし、野生株と2種のMn輸送欠損株との感受性の差異は大きく変わらなかった。このように、細胞内Mn蓄積量の変動によって、DNA損傷応答機構に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。

在耐辐射细菌耐辐射球菌的DNA损伤反应机制中，无论DNA损伤如何，PprI蛋白都会持续表达，这表明存在一种在DNA损伤时激活PprI蛋白的机制。 PprI 蛋白通过将 Mn 配位到其活性中心而具有金属蛋白酶活性。因此，我们重点关注编码参与 Mn 进出细胞转运的蛋白质的基因（DR1709 和 DR2523），这些蛋白质被认为与 PprI 蛋白的激活有关，并通过破坏这些基因，我们试图分析对DNA损伤反应机制的影响。具体而言，通过将卡那霉素抗性基因盒与通过PCR扩增DR1709和DR2523基因的上游和下游区域(约800bp)而获得的各DNA片段连接来制作用于基因破坏的DNA片段。使用获得的DNA片段转化Radiodurans的野生型菌株，并创建了两种类型的Mn转运缺陷突变体。当我们研究细胞内锰积累量及其对增殖的影响时，我们发现由于锰转运缺陷，与野生型相比，增殖延迟。 DR1709缺陷型突变体的生长迟缓被认为是由于转运到细胞中的锰量减少所致。另一方面，DR2523缺陷突变株的生长迟缓被认为是由于细胞外Mn排泄减少导致细胞内Mn积累过多，导致生长迟缓。此外，测量了Mn传输缺陷应变对伽马射线的敏感性。因此，与野生型相比，两种锰转运缺陷菌株都高度敏感。此外，通过在培养基中添加锰，野生型菌株和锰转运缺陷菌株都表现出更好的伽马射线抵抗力。然而，野生型菌株和两种锰转运缺陷菌株之间的敏感性差异没有显着差异。通过这种方式，我们揭示了细胞内Mn积累量的变化对DNA损伤反应机制有显着影响。