Screening of microbial amide-bond forming enzyme for stabilization and functionalization of bioactive fatty acids

用于稳定和功能化生物活性脂肪酸的微生物酰胺键形成酶的筛选

基本信息

批准号：
21K05340
负责人：
原良太郎
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

脂肪酸のカルボキシ基にアミンを付加した脂肪酸アミドは、可塑剤として利用されているだけでなく、新たな脂質メディエーターとしての利用が期待される有用化合物である。酵素や微生物を活用したバイオプロセスにより脂肪酸アミドを生産することが可能となれば、化学合成法に依存した現行の製法の代替となり得る。本研究では、多様な脂肪酸のカルボキシ基にアミン類を付加した脂肪酸アミドを生産するための微生物探索と、バイオプロセスへの応用を目指している。今年度は、昨年度見出した脂肪酸アミド生産菌からの酵素精製ならびに遺伝子クローニングを実施した。まず、スクリーニングにより取得したMycobacterium sp. AKU 2014に由来する脂肪酸アミド合成酵素を特定するために、酵素精製を行った。AKU 2014株の無細胞抽出液から4段階のカラムクロマトグラフィーにより部分精製酵素を取得した。精製度は595倍、回収率は0.21 %であり、分子量はSDS-PAGE上で約41,000であった。目的酵素活性と連動するバンドをSDS-PAGEゲルから切り出して、アミノ酸配列を解析したところ、19残基まで配列を取得した。相同性検索の結果、当該酵素のN-末端アミノ酸配列は、データベース上のセリンプロテアーゼと類似性を示した。次に、同定した酵素の組換え大腸菌における発現を試みた。データベースの情報をもとに、目的酵素をコードする遺伝子をPCRにより増幅し、発現用プラスミドに連結した。当該プラスミドを大腸菌に導入し、発現試験を行った。SDS-PAEG分析の結果、目的酵素が可溶性画分に発現していることが確認できた。また、酵素活性を確認したところ、オレイン酸からオレアミド、エルカ酸からエルカミドを合成する活性を認めた。このことから、AKU 2014株のセリンプロテアーゼ様酵素は、脂肪酸アミドの合成活性を有することが判明した。

脂肪酸酰胺是一种有用的化合物，其中胺被添加到脂肪酸的羧基上，预计不仅可用作增塑剂，还可用作新的脂质介体。如果可以通过利用酶和微生物的生物过程来生产脂肪酸酰胺，那么它可能会成为目前依赖化学合成的生产方法的替代方案。在这项研究中，我们的目标是寻找能够产生脂肪酸酰胺的微生物，并将胺添加到各种脂肪酸的羧基上，并将其应用于生物过程。今年，我们对去年发现的脂肪酸酰胺产生菌进行了酶纯化和基因克隆。首先，为了鉴定筛选得到的来自分枝杆菌AKU 2014的脂肪酸酰胺合酶，进行了酶纯化。通过四步柱层析从 AKU 2014 菌株的无细胞提取物中获得部分纯化的酶。纯化度为595倍，回收率为0.21%，SDS-PAGE分子量约为41,000。当从SDS-PAGE凝胶上切下与目标酶活性相关的条带并分析其氨基酸序列时，获得了多达19个残基的序列。同源性搜索的结果显示，该酶的 N 端氨基酸序列与数据库中列出的丝氨酸蛋白酶相似。接下来，我们尝试在重组大肠杆菌中表达所鉴定的酶。根据数据库中的信息，通过PCR扩增编码目标酶的基因并连接至表达质粒。将质粒导入大肠杆菌并进行表达测试。 SDS-PAEG分析的结果证实，目标酶在可溶级分中表达。此外，当确认酶活性时，观察到由油酸合成油酰胺和由芥酸合成芥酸酰胺的活性。由此可知，AKU 2014株的丝氨酸蛋白酶样酶具有脂肪酸酰胺合成活性。