転写・内在tRNAハイブリッド無細胞翻訳系を用いたアミノ酸入れ替え遺伝暗号の構築

使用转录/内源tRNA杂合无细胞翻译系统构建氨基酸置换遗传密码

• 批准号: 21K05270
• 负责人: 藤野 公茂
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05270/
• 关键词: 無細胞翻訳系; キメラtRNA; 改変遺伝暗号; tRNA; 遺伝暗号

申請者が先行研究で提案したアミノ酸入れ替え(AS)遺伝暗号は、Ser, Leuコドンの交換により、普遍遺伝暗号との直交性を確立している。この系は、試験管内翻訳系により、危険な遺伝子を用いず研究対象のタンパク質のみを得る手段として有用である。しかし、AS遺伝暗号を持つ翻訳系は、タンパク質合成量が、通常の系の10分の1程度と低いという問題があった。これは、用いたtRNAが転写後修飾を持たず、必要最小限の21種類しか用意していないことが原因であると考えられる。そこで、本研究では、『大腸菌抽出の内在tRNAと、試験管内転写tRNAを組み合わせることにより、翻訳合成活性の高いアミノ酸入れ替え遺伝暗号を構築すること』を目指した。初年度である2021年には、変性PAGEを用いることで、内在tRNAからSer, LeuのtRNAのみを選択的に除去する方法を考案した。ここに、試験管内転写により合成した2種類のキメラtRNAを添加することで、内在・転写ハイブリッドtRNAを構築することに成功した。このハイブリッドtRNAを用いることで、ペプチドとタンパク質のアミノ酸入れ替え翻訳合成が可能であることも示した。2022年度の取り組みでは、アミノ酸入れ替え翻訳系で利用可能なコドンの拡大を目指して研究を進めた。前年度の段階で構築した翻訳系は、Ser, Leuに対応するtRNAが各1種類であるため、利用可能なコドンの数が、理論上の最大で64個中54個であった。そこで、Ser, Leuに対応するキメラtRNAをさらに追加し、利用可能なコドンを61個まで拡張することを目指した。利用可能なコドンが増えることで、遺伝子の設計時におけるコドン選択の自由度が上がり、遺伝子から翻訳合成によって得られる研究対象となるタンパク質収量の増加が期待される。

申请人在前期研究中提出的氨基酸取代（AS）遗传密码通过交换Ser和Leu密码子，与通用遗传密码建立了正交性。该系统可用作使用体外翻译系统仅获得感兴趣的蛋白质而不使用危险基因的手段。然而，具有AS遗传密码的翻译系统存在一个问题，即合成的蛋白质量只有正常系统的十分之一左右。这被认为是因为所使用的tRNA没有转录后修饰，并且只制备了最少必需的21种。因此，在这项研究中，我们的目标是“通过将从大肠杆菌中提取的内源性tRNA与体外转录的tRNA相结合，构建具有高翻译合成活性的氨基酸替代遗传密码。” 2021 年，即第一年，我们设计了一种通过使用变性 PAGE 从内源 tRNA 中仅选择性去除 Ser 和 Leu tRNA 的方法。通过添加体外转录合成的两种嵌合tRNA，我们成功构建了内源/转录杂合tRNA。我们还证明，通过使用这种混合 tRNA，可以通过交换氨基酸来翻译和合成肽和蛋白质。在 2022 年的努力中，我们开展了旨在扩大可用于氨基酸替换翻译系统的密码子数量的研究。去年构建的翻译系统具有 Ser 和 Leu 各一种类型的 tRNA，因此可用密码子的数量为理论最大值 64 个中的 54 个。因此，我们添加了对应于Ser和Leu的嵌合tRNA，旨在将可用密码子的数量扩展到61个。可用密码子数量的增加将增加基因设计过程中密码子选择的自由度，并有望增加通过翻译合成从基因中获得的目的蛋白质的产量。

项目成果

転写・抽出tRNAを用いた高効率Ser/Leu交換翻訳系の開発

使用转录/提取的 tRNA 开发高效 Ser/Leu 交换翻译系统

• 发表时间: 2022
• 作者: Kubo Anna;Tanei Tomonori;Pradipta Ambara R;Morimoto Koji;Fujii Motoko;Sota Yoshiaki;Miyake Tomohiro;Kagara Naofumi;Shimoda Masafumi;Naoi Yasuto;Motoyama Yuichi;Morii Eiichi;Tanaka Katsunori;Shimazu Kenzo;園田 凌吾,藤野 公茂,村上 裕
• 通讯作者: 園田 凌吾,藤野 公茂,村上 裕

Construction of a Highly Diverse mRNA Library for in vitro Selection of Monobodies

• DOI: 10.21769/bioprotoc.4125
• 发表时间: 2021-08-20
• 期刊: BIO-PROTOCOL
• 影响因子: 0.8
• 作者: Kondo, Taishi;Eguchi, Minori;Murakami, Hiroshi
• 通讯作者: Murakami, Hiroshi

創薬研究者がこれだけは知っておきたい最新のウイルス学

药物发现研究人员需要了解的最新病毒学知识

• 发表时间: 2021
• 作者: 執筆者:101名;技術情報協会
• 通讯作者: 技術情報協会

アミノ酸交換遺伝暗号の構築

氨基酸交换遗传密码的构建

• 发表时间: 2021
• 作者: 有安 真也;児玉 侑朔;愛場 雄一郎;荘司 長三;Yuya Komatsu; Jun Sugiyama; Ryota Shimizu; Kazunori Nishio; Masahiro Miyauchi; Markus Wilde; Katsuyuki Fukutani; Ryan McFadden; Martin Dehn; Victoria Karner; Derek Fujimoto; John Ticknor; Aris Chatzichristos; Monika Stachura; David Cortie; Gerald Morris; ;藤野公茂,戸崎将弘,村上裕
• 通讯作者: 藤野公茂,戸崎将弘,村上裕

WYP-rich 大環状ペプチドライブラリによる効率的なペプチド選択

使用富含 WYP 的大环肽库进行高效肽选择

• 发表时间: 2022
• 作者: Takemura-Uchiyama Iyo;Tsurui Hiroki;Shimakura Hidekatsu;Nasukawa Tadahiro;Imanishi Ichiro;Uchiyama Jumpei;Fukuyama Tomoki;Sakamoto Shuji;Morisawa Keiko;Fujimura Masato;Murakami Hironobu;Kanamaru Shuji;Kurokawa Kenji;Kawamoto Keiko;Iyori Keita;Sakaguchi Ma;藤野 公茂,鷲見 大河,村上 裕
• 通讯作者: 藤野 公茂,鷲見 大河,村上 裕