Factors involved in difficult-to-express protein production and their characterization

难以表达的蛋白质产生所涉及的因素及其表征

• 批准号: 21K04795
• 负责人: 河原崎 泰昌
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: University of Shizuoka
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K04795/
• 关键词: 出芽酵母発現系; 組換え蛋白質; 難生産性蛋白質; 転写因子; 難生産性組換え蛋白質; 酵母異種蛋白質発現系; 機能未知転写因子; レアコドン; プロモーター; 組換え蛋白質分泌生産; 遺伝子工学; 遺伝子発現制御; 酵素; 遺伝子発現; 蛋白質生産; 進化工学

発現による宿主細胞への毒性や、不十分な折りたたみにより活性型発現が困難である「難生産性組換え蛋白質」の発現系を構築し、難生産性の効率的回避手段を提案することを目的とする。これまでに「組換え酵母細胞を高密度に懸濁し、発現誘導を行う」という簡便な操作により、難生産性蛋白質の分泌生産量が飛躍的（菌体あたり千倍）に高まる現象を見出し、この「高密度発現系」の分子機構を基礎として研究を展開してきた。高密度発現系において発現量が増大する宿主遺伝子としてYgr067C遺伝子に着目した。同遺伝子は機能未知の転写因子をコードしており、自身の発現を負に調節した。その後の解析により、培地中の糖濃度の低下に応答して同遺伝子の発現量が増加し、ミトコンドリア蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節すること、無酸素条件下で細胞をG1期で停止させること、発現した転写因子は細胞周期に依存して分解されることを明らかにした。同遺伝子欠損株は、無酸素条件下における細胞周期の停止が明確ではなく、定常期における蛋白質合成速度が増大していた。同遺伝子のプロモーター領域を目的蛋白質遺伝子に連結し、同遺伝子欠損株にて発現させたところ、培養後期に著量の蛋白質を生産することが可能となった。他方、出芽酵母で発現毒性を示す分泌蛋白質である糸状菌β-ガラクトシダーゼ（lacA蛋白質）をモデル蛋白質として、同酵素の活性型発現が生育にとって必須となる培地条件（ラクトースのみを炭素源とする低栄養合成培地）を用い、プロモーターの最適化を行った。具体的には、lacA遺伝子上流域に酵母染色体DNAの限定加水分解断片をクローン化してライブラリーを作製し、平板寒天培地上で繰り返し良好生育株を選別した。選択されたプロモーター配列の性質決定を行ったところ、恒常的に弱い遺伝子発現を引き起こすDNA断片が最適プロモーターとして選択されたことがわかった。

目的是针对因对宿主细胞有毒性或折叠不充分而难以以活性形式表达的“难以产生重组蛋白”的表达系统，并提出避免生产力低下的有效手段。迄今为止，我们发现了一种现象，即通过“高密度悬浮重组酵母细胞并诱导表达”的简单操作，难以产生的蛋白质的分泌量急剧增加（每个细菌细胞1,000倍）。 ”我们一直在基于这种“高密度表达系统”的分子机制进行研究。我们重点关注Ygr067C基因作为宿主基因，其表达水平在高密度表达系统中增加。该基因编码一种功能未知的转录因子，并负向调节其自身的表达。随后的分析表明，该基因的表达水平随着培养基中糖浓度的降低而增加，调节线粒体蛋白编码基因的表达，并使细胞在缺氧条件下停滞在 G1 期。表达的转录因子根据细胞周期被降解。在基因缺陷菌株中，在缺氧条件下没有明显观察到细胞周期停滞，并且稳定期蛋白质合成速率增加。当该基因的启动子区域与目标蛋白质基因连接并在缺乏该基因的菌株中表达时，在培养后期就可以产生大量的蛋白质。另一方面，我们使用丝状真菌β-半乳糖苷酶（lacA蛋白）（一种在酿酒酵母中表达并表现出毒性的分泌蛋白）作为模型蛋白，并使用合成营养培养基对启动子进行了优化。具体来说，将酵母染色体DNA的有限水解片段克隆到lacA基因的上游区域以创建文库，并在平板琼脂平板上重复选择生长良好的菌株。对所选启动子序列的表征表明，始终导致基因表达较弱的 DNA 片段被选为最佳启动子。

项目成果

麹菌においてカーボンカタボライト抑制を制御する脱ユビキチン化酵素CreB はユビキチンリガーゼアダプターCreD の転写誘導とタンパク質安定性を制御する

去泛素化酶 CreB 控制米曲霉中碳分解代谢物的抑制，也控制泛素连接酶接头 CreD 的转录诱导和蛋白质稳定性。

• 发表时间: 2022
• 作者: 岩崎良章;池田房雄;中山 光;高木章乃夫;岡田裕之;Yohei Ishida;田中 瑞己，藤田 翔貴，河原崎 泰昌，山形 洋平
• 通讯作者: 田中 瑞己，藤田 翔貴，河原崎 泰昌，山形 洋平

T7ファージによる蛋白質の折りたたみ改善配列の自律探索

使用 T7 噬菌体自主搜索蛋白质折叠改进序列

• 发表时间: 2021
• 作者: 宮本 萌衣;河原崎 泰昌;田中 瑞己
• 通讯作者: 田中 瑞己

マイタケ（Grifola frondosa）子実体で発現するプロテアーゼ遺伝子群の同定と異種発現系による性質決定

使用异源表达系统鉴定灰树花子实体中表达的蛋白酶基因并进行表征

• 发表时间: 2023
• 作者: 長嶋優芽;栗田涼子;田中瑞己;河原崎泰昌
• 通讯作者: 河原崎泰昌

出芽酵母機能未知転写因子 Ygr067C の標的遺伝子の同定

酿酒酵母功能未知转录因子Ygr067C靶基因的鉴定

• 发表时间: 2022
• 作者: 栗田 涼子;河原崎 泰昌;田中 瑞己
• 通讯作者: 田中 瑞己

High Cell-Density Expression System: Yeast Cells in a Phalanx Efficiently Produce a Certain Range of “Difficult-to-Express” Secretory Recombinant Proteins

高细胞密度表达系统：方阵中的酵母细胞高效产生一系列“难以表达”的分泌型重组蛋白

• DOI: 10.1007/978-1-0716-1859-2_16
• 发表时间: 2022
• 期刊: Methods in Molecular Biology
• 作者: Kawarasaki Yasuaki;Kurose Takeshi;Ohashi Sayaka;Watabe Runa;Tanaka Mizuki;Ito Keisuke
• 通讯作者: Ito Keisuke