磁性カーボンナノ粒子の光発熱効果を利用した高効率 PCR 法の開発

利用磁性碳纳米粒子的光热效应开发高效PCR方法

• 批准号: 21K03921
• 负责人: 森本 久雄
• 金额: $ 1.5万
• 依托单位: Toyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K03921/
• 关键词: PCR; ナノ粒子; 光発熱効果

2022 年度は，前年度に構築した実験システムを用い 2 段階 PCR を行った．本手法により従来法（サーマルサイクラーを用いた PCR）と同等の増幅量を保ちながらプロセス時間を短縮することに成功した．さらに本研究では PCR によって得られた主生成物（増幅対象である DNA 断片）だけでなく副産物（反応中に生成した増幅対象とは異なる配列・サイズの DNA 断片）の生成量も解析した．解析の結果，本手法では従来法に比べて副産物の生成量が少ないことがわかった．前述の通り本手法では従来法に比べて高速でサーマルサイクリングを行っており，これにより副産物の生成が抑制されたものと考えられる．次に本手法で熱源として使用する磁性カーボンナノ粒子の再利用について検討を行った．ナノ粒子を用いて 2 段階 PCR を行い，その後に反応溶液中の粒子を磁石により集めて上澄み液をピペットで取り除いた．次に粒子を滅菌水でウオッシュし，PCR に必要な各種薬品を加えて再度 2 段階 PCR を行った．再利用した粒子を用いた場合も従来法に比べて高速で PCR を行うことに成功したが，DNA 断片の増幅量は初回に比べて減少した．本研究では DNA 断片の増幅に必要な DNA ポリメラーゼが粒子に吸着して失活することを防ぐために，粒子表面を BSA（ウシ血清アルブミン）でブロッキングしている．初回の PCR において，粒子の発熱に起因して一部の BSA 分子は粒子から離脱している可能性があり，これによって DNA ポリメラーゼが失活し増幅量が減少したものと推察される．さらに本研究では，3 段階 PCR を行うための実験条件について検討を行った．本手法による 3 段階 PCR を行い，ターゲット DNA の増幅に成功した．

在2022财年，使用上一年建造的实验系统进行了两个阶段PCR。该方法成功地减少了过程时间，同时保持与常规方法（使用热循环的PCR）相同的扩增。在这项研究中，我们不仅分析了通过PCR获得的主要产物（DNA片段被放大），还通过 - 产品（序列的DNA片段和大小的DNA片段与在反应过程中产生的扩增靶标的）不同。分析的结果是，该方法表明，生产的量小于常规方法。如上所述，与常规方法相比，该方法在高速下进行热循环，从而抑制了生产的产生。接下来，我们检查了该方法中用作热源的磁性碳纳米颗粒的重复使用。使用纳米颗粒进行两个 - 步骤PCR，然后用磁铁收集反应溶液中的颗粒，并用移液器除去上清液溶液。接下来，用灭菌水洗涤颗粒，并加入PCR所需的各种药物，然后再次进行PCR。即使使用了重复使用的颗粒，与常规方法相比，PCR仍以高速进行成功，但是与首次相比，DNA片段的量减少了。在这项研究中，颗粒表面被BSA（CAT Dorman白蛋白）阻塞，以防止放大DNA片段所需的DNA聚合酶被吸收到颗粒中。在第一个PCR中，由于颗粒的发烧，某些BSA分子可能已经离开了颗粒，这假定DNA聚合酶已经不活跃，并且扩增已减少。此外，在这项研究中，我们检查了执行三阶段PCR的实验条件。我们通过这种方法进行了三阶段的PCR，并成功地扩增了目标DNA。