雄マウス求愛発声と性的動機づけを担うドーパミン神経投射経路の同定

鉴定负责雄性小鼠求爱发声和性动机的多巴胺神经元投射通路

基本信息

批准号：
21K03144
负责人：
菅野康太
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本実験では、ファイバーフォトメトリーによる神経活動観察と光遺伝学による神経活動の操作を、USVsの観察と同期記録しながら行う。本研究ではドーパミン (DA)神経系に着目しており、その神経活動の観察と神経活動操作をするための分子ツールを発現させる必要がある。DA神経系特異的に各種ツールの遺伝子を発現させるために、DA合成に必要な酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)遺伝子のプロモーター下流でDNA組換え酵素であるCreを発現するアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター(TH::Cre)を用いる。さらに、分子ツールの遺伝子配列が逆向きに挿入されているAAVで、Cre存在下では組換えによりその向きが正常になり、遺伝子発現がなされるDIO(doublefloxed inverted open-reading-frame)のシステムを用い、Cre::THと特定の脳部位・回路で2重感染させることで、DA神経特異的に分子ツールを発現させる。分子ツールとしては、神経活動が上昇した際のカルシウムイオン濃度の上昇に応じて緑色蛍光の強度が増すCa2+センサーである GCaMP6を用いる。神経活動操作においては、560nm付近の光に応答し神経活動を抑制するArchTや、465nm付近の光に応答して神経を活性化(脱分極)させるチャネルロドプシン2(ChR2)を用いる。これらの手法を用いて、DA神経活動とUSVsの多さや複雑さとの因果を示し、さらに責任神経回路(投射経路)を機能的に同定する。これまでに、これらAAVの導入を済ませ、脳での発現確認を行った（AAV2retroによる特定の神経投射での逆光性感染も確認）。しかし、まだ仮説検証には至っていない。また、2個体間の発声の解析を進めるための実験系も別途開発し、論文として公開した。

在此实验中，在记录USV的观察结果时，使用光遗传学对神经活动进行观察和对神经活动的操纵。这项研究侧重于多巴胺（DA）神经系统，有必要表达观察其神经活性和操纵神经活动的分子工具。为了表达特定于DA神经系统中的各种工具的基因，腺相关病毒（AAV）载体（TH :: CRE）在酪氨酸羟化酶（TH）基因的启动子上表达DNA重组酶CRE，这是DA合成所需的酶。 Furthermore, in AAVs in which the gene sequence of the molecular tool is inserted in reverse, the DIO (doublefloxed inverted open-reading frame) system in which the orientation is normalized by recombination in the presence of Cre and gene expression is carried out, and by double infection with Cre::TH at specific brain sites and circuits, the molecular tool is expressed specifically in the DA nerve.作为分子工具，GCAMP6是一种Ca2+传感器，它响应于当神经活性增加时钙离子浓度的增加而增加绿色荧光的强度。在神经活动操作中，ArchT对560 nm的光反应并抑制神经活动，而通道旋转2（CHR2），它使用响应于465 nm的光线而激活（去极化）神经。使用这些技术，我们证明了DA神经活动的因果关系和USV的复杂性，并在功能上确定了负责任的神经回路（投影途径）。到目前为止，这些AAV已被引入并证实了它们在大脑中的表达（并且还通过AAV2Retro确认了带有特定神经投射的背光感染）。但是，该假设尚未得到检验。此外，分别开发了一个实验系统，以推动两个个体之间发声的分析并作为论文发表。