雄マウス求愛発声と性的動機づけを担うドーパミン神経投射経路の同定

鉴定负责雄性小鼠求爱发声和性动机的多巴胺神经元投射通路

基本信息

批准号：
21K03144
负责人：
菅野康太
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本実験では、ファイバーフォトメトリーによる神経活動観察と光遺伝学による神経活動の操作を、USVsの観察と同期記録しながら行う。本研究ではドーパミン (DA)神経系に着目しており、その神経活動の観察と神経活動操作をするための分子ツールを発現させる必要がある。DA神経系特異的に各種ツールの遺伝子を発現させるために、DA合成に必要な酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)遺伝子のプロモーター下流でDNA組換え酵素であるCreを発現するアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター(TH::Cre)を用いる。さらに、分子ツールの遺伝子配列が逆向きに挿入されているAAVで、Cre存在下では組換えによりその向きが正常になり、遺伝子発現がなされるDIO(doublefloxed inverted open-reading-frame)のシステムを用い、Cre::THと特定の脳部位・回路で2重感染させることで、DA神経特異的に分子ツールを発現させる。分子ツールとしては、神経活動が上昇した際のカルシウムイオン濃度の上昇に応じて緑色蛍光の強度が増すCa2+センサーである GCaMP6を用いる。神経活動操作においては、560nm付近の光に応答し神経活動を抑制するArchTや、465nm付近の光に応答して神経を活性化(脱分極)させるチャネルロドプシン2(ChR2)を用いる。これらの手法を用いて、DA神経活動とUSVsの多さや複雑さとの因果を示し、さらに責任神経回路(投射経路)を機能的に同定する。これまでに、これらAAVの導入を済ませ、脳での発現確認を行った（AAV2retroによる特定の神経投射での逆光性感染も確認）。しかし、まだ仮説検証には至っていない。また、2個体間の発声の解析を進めるための実験系も別途開発し、論文として公開した。

在本实验中，我们将使用光纤光度测定法观察神经活动，并使用光遗传学操纵神经活动，同时观察和记录同步 USV。这项研究的重点是多巴胺（DA）神经系统，有必要开发分子工具来观察和操纵神经活动。为了表达 DA 神经系统特有的各种工具的基因，我们开发了一种腺相关病毒 (AAV) 载体 (TH::Cre)。此外，我们还开发了DIO（double floxed inverted open-reading-frame）系统，其中分子工具的基因序列以相反方向插入，在Cre存在下，通过重组使方向变得正常并发生基因表达通过用 Cre::TH 双重感染特定的大脑区域和回路，分子工具在 DA 神经元中特异性表达。使用的分子工具是GCaMP6，这是一种Ca2+传感器，当神经活动增加时，其绿色荧光随着钙离子浓度的增加而增加。为了操纵神经活动，我们使用了 ArchT（它会抑制对 560 nm 左右光的反应的神经活动）和视紫红质通道蛋白 2 (ChR2)（它会响应 465 nm 左右的光来激活（去极化）神经）。使用这些方法，我们将证明 DA 神经活动与 USV 的数量和复杂性之间的因果关系，并在功能上识别负责的神经回路（投射路径）。到目前为止，我们已经引入了这些 AAV 并证实了它们在大脑中的表达（还证实了 AAV2retro 对特定神经投射的逆转录感染）。然而，该假设尚未得到验证。我们还单独开发了一个实验系统来分析两个人之间的发声，并将其作为论文发表。