Generation and application of hPSC-derived bone organoids based on the human skeletal development

基于人类骨骼发育的hPSC源性骨类器官的制备及应用

• 批准号: 21J12970
• 负责人: 谷 彰一郎
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J12970/
• 关键词: ヒト多能性幹細胞; 骨発生; 軟骨内骨化; シングルセル解析; 遺伝子制御ネットワーク; ZEB2; 内軟骨性骨化; １細胞解析; 遺伝子発現制御機構

ヒト多能性幹細胞を骨格の起源細胞の一つである沿軸中胚葉（椎板細胞）へ分化させたのちに免疫不全マウス腎皮膜下へ移植することでヒト細胞によって構成される骨組織を作出し、シングルセル解析を実施した。シングルセルRNA-seqに加えてATAC-seqも加えた、シングルセルMultiome解析による結果をさらに検証し、ヒトの骨発生における骨格細胞の遺伝子制御ネットワークについて検討した。各細胞種には独自ないしは共通する転写因子群が活性化していることが明らかとなり、細胞の運命決定や分化、機能維持において様々な転写因子が協調して機能していることが示唆された。一方でこの手法の場合、検出できる転写因子の数に限度があったことから、RNA velocity解析と細胞種特異的な発現遺伝子の組み合わせによって全ての転写因子の中から骨芽細胞分化に重要な因子の抽出を試み、神経や悪性腫瘍の領域では機能がよく知られているものの、骨組織における機能が明らかでなかったZEB2を同定した。ZEB2は骨領域において骨芽細胞のマスターレギュレーターであるRUNX2やSP7と共発現し、shRNAを用いたノックダウンをヒト間葉系幹細胞に行うと、骨芽細胞分化に重要な遺伝子群の発現が低下した。加えて、骨芽細胞特異的にZEB2を欠失させるノックアウトマウスを作出したところ、胎児期ないしは新生児期において骨格の低形成が特に頭顔面部（沿軸中胚葉および神経堤由来）において顕著であることが確認された。これらの結果は、ZEB2が骨発生過程において複数の転写因子群を制御する転写制御ネットワークの一端であることを示唆していると考えられた。以上の内容を国際・国内学会で報告するとともに、国際学術誌であるCell Reportsへ投稿・掲載した。

通过将人类多能干细胞分化为骨骼起源细胞之一的轴旁中胚层（椎间盘细胞），然后将其移植到免疫缺陷小鼠的肾被膜下，产生并形成由人类细胞组成的骨组织。进行了单细胞分析。除了单细胞RNA-seq之外，我们还使用ATAC-seq进一步验证了单细胞多组分析的结果，并研究了人类骨骼发育过程中骨骼细胞的基因调控网络。已经清楚的是，每种细胞类型都有一组独特或共同的转录因子被激活，这表明各种转录因子在细胞命运决定、分化和功能维持中共同发挥作用。另一方面，使用这种方法，可以检测到的转录因子的数量是有限的，因此结合RNA速度分析和细胞类型特异性表达基因来鉴定对成骨细胞分化重要的因子。我们尝试提取ZEB2并鉴定出ZEB2，众所周知，ZEB2在神经和恶性肿瘤中具有功能，但其在骨组织中的功能尚不清楚。 ZEB2 与成骨细胞的主要调节因子 RUNX2 和 SP7 在骨区域共表达，当对人间充质干细胞进行基于 shRNA 的敲除时，对成骨细胞分化重要的基因的表达就会减少。此外，当我们培育成骨细胞中ZEB2被特异性删除的基因敲除小鼠时，在胎儿期或新生儿期，颅面部区域（源自轴旁中胚层和神经嵴）的骨骼发育不全尤其明显。这些结果表明ZEB2是转录调控网络的一部分，在骨骼发育过程中控制多个转录因子。上述内容在国际国内学术会议上进行了报告，并在国际学术期刊Cell Reports上投稿发表。

项目成果

Elucidating human skeletal development using single-cell analyses with a model of endochondral bone formation using human pluripotent stem cells

利用人类多能干细胞软骨内骨形成模型进行单细胞分析，阐明人类骨骼发育

• 发表时间: 2021
• 作者: Shoichiro Tani;Hiroyuki Okada;Masahide Seki;Yutaka Suzuki;Taku Saito;Sakae Tanaka;Ung-il Chung;Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
• 通讯作者: Hironori Hojo and Shinsuke Ohba

Elucidating Gene Regulatory Networks Underlying Human Skeletal Development by Integrating a Model of Human Endochondral Bones and Single-cell Multiomics

通过整合人类软骨内骨模型和单细胞多组学来阐明人类骨骼发育背后的基因调控网络

• 发表时间: 2022
• 作者: Shoichiro Tani;Hiroyuki Okada;Masahide Seki;Yutaka Suzuki;Taku Saito;Sakae Tanaka;Ung-il Chung;Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
• 通讯作者: Hironori Hojo and Shinsuke Ohba

ヒト多能性幹細胞由来3次元骨組織誘導法と単一細胞解析を用いたヒト骨形成機構の探索

利用人类多能干细胞来源的3D骨组织诱导方法和单细胞分析探索人类骨形成机制

• 发表时间: 2021
• 作者: 谷 彰一郎; 岡田 寛之; 齊藤 琢; 田中 栄; 鄭 雄一; 北條 宏徳; 大庭 伸介
• 通讯作者: 大庭 伸介

Elucidating Human Skeletal Development Using Single-Cell Analysis By Inducing Bone Tissue Formation From Human Pluripotent Stem Cells

通过诱导人类多能干细胞形成骨组织，利用单细胞分析阐明人类骨骼发育

• 发表时间: 2021
• 作者: Shoichiro Tani;Hiroyuki Okada;Masahide Seki;Yutaka Suzuki;Taku Saito;Sakae Tanaka;Ung-il Chung;Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
• 通讯作者: Hironori Hojo and Shinsuke Ohba

ELUCIDATING HUMAN SKELETAL DEVELOPMENT BY INTEGRATING SINGLE-CELL ANALYSIS AND BONE TISSUE INDUCTION USING HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS

通过整合单细胞分析和使用人类多能干细胞的骨组织诱导来阐明人类骨骼发育

• 发表时间: 2021
• 作者: Shoichiro Tani;Hiroyuki Okada;Masahide Seki;Yutaka Suzuki;Taku Saito;Sakae Tanaka;Ung-il Chung;Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
• 通讯作者: Hironori Hojo and Shinsuke Ohba