ビリン色素合成酵素の機構解明および機能改変による新規ビリン色素合成酵素の創出

阐明胆色素合酶的机制并通过功能修饰创建新型胆色素合酶

• 批准号: 21J12968
• 负责人: 三宅 敬太
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J12968/
• 关键词: 光遺伝学; 色素合成酵素; ビリン色素

ビリン色素はAからDまでの4つのピロール環が直鎖状に並んだ色素であるが、C-D環の間の二重結合は、光受容体シアノバクテリオクロム（CBCR）の光感知に必須である。既知のビリン色素合成酵素は、フェレドキシン依存性ビリン還元酵素（FDBR）と呼ばれる大きなスーパーファミリーを形成し、還元箇所が多様化しているが、A-B環の間の二重結合のみを特異的に還元する酵素は知られていない。この箇所の還元は、色素の吸収を大幅に短波長化できるため、CBCRが感知する光質も同様に短波長化できると期待される。私はビリン色素合成酵素の中でも、基質ビリベルジンのC-D環の間の二重結合とA-B環の間の二重結合を順に単結合に還元するPubSという酵素を土台に、合理的改変を施すことで、前半のC-D環の間の二重結合の還元活性のみを失活させることを目指した。現在まで2つの目標を設定し、PubS酵素を対象とした研究を実施した。1つはPubSの分子構造解析であり、X線結晶構造解析を行うための結晶化条件の検討を進めている。結晶化条件は未だに見出せていないが、AlphaFold2で構造予測をすることで、基質非結合状態の分子構造のモデルを作出することに成功した。2つ目はPubS酵素への変異を導入することで、新規の色素を合成する酵素を作出することである。予測構造と配列比較を組み合わせることで、色素の結合様式に関わると考えられるモチーフ配列を見出し、実際に変異を導入した。その結果、見出したモチーフが、色素が結合する際の色素の配向を決めており、それによって、二段階の還元反応の最初の反応が阻害されるという結果が得られた。今回の変異導入では、二段階の反応の後半の反応を阻害することができたのだが、新規の色素を合成するには、前半の反応のみを阻害する必要がある。今後、さらに変異導入を行うことで、そのような改変が実現できると期待される。

比林颜料是由A至D的四个吡咯环排列成线性链的颜料，C-D环之间的双键对于光感受器蓝藻色素(CBCR)的光感应至关重要。已知的胆色素合酶形成一个大的超家族，称为铁氧还蛋白依赖性胆色素还原酶（FDBR），尽管还原位点多种多样，但它们仅具体还原 A-B 环之间的双键尚不清楚。此时的减少可以显着缩短染料吸收的波长，因此预计CBCR检测到的光质量的波长也可以缩短。在胆绿素合成酶中，我开发了一种称为PubS的酶，通过进行合理的修饰，将底物胆绿素的C-D环之间的双键和A-B环之间的双键依次还原为单键，目的是仅失活。前半部分C-D环间双键的还原活性。迄今为止，我们已经设定了两个目标并针对 PubS 酶进行了研究。一是PubS的分子结构分析，我们目前正在研究用于X射线晶体结构分析的结晶条件。尽管尚未找到结晶条件，但通过使用 AlphaFold2 预测结构，我们成功创建了非底物结合状态下的分子结构模型。第二步是通过在 PubS 酶中引入突变来创建一种合成新色素的酶。通过结合预测的结构和序列比较，他们发现了一个被认为参与染料结合模式的基序序列，并实际上引入了突变。研究人员发现，他们发现的基序决定了染料结合时的方向，从而抑制了两步还原反应中的第一个反应。通过引入这种突变，我们能够抑制两步反应的后半部分，但为了合成新的染料，有必要仅抑制反应的前半部分。预计未来通过引入进一步的突变，这种修饰将成为可能。

项目成果

ビリン色素合成酵素の機構解明および機能改変による新規ビリン色素合成酵素の創出

阐明胆色素合酶的机制并通过功能修饰创建新型胆色素合酶

• 发表时间: 2021
• 作者: 三宅 敬太;岩田 紗弥;伏見 圭司;成川 礼
• 通讯作者: 成川 礼