転写プラットフォーム因子Zfhxファミリーによる骨格形成の時空間的制御機構の解明

转录平台因子Zfhx家族阐明骨骼形成的时空控制机制

• 批准号: 21H04841
• 负责人: 西村 理行
• 金额: $ 26.87万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-05 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H04841/
• 关键词: 転写因子; 骨代謝; 軟骨代謝; 骨系統疾患; ゲノム編集; 軟骨; 骨; Zfhx4; 内軟骨性骨形成; 転写プラットフォーム; 骨形成

１．Zfhx3およびZfhx4の標的遺伝子を解析するために、Flagタグを付与したZfhx4ノックインマウスから細胞を採取し、抗Flag抗体を用いたクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、その最適化を行った。またクロマチン構造の解析を行うために、従来より行われているATAC-seq解析より鋭敏であるとされている、Cut&Run法での解析手法の解析化を行った。これらの研究結果より、Flag-Zfhx4ノックインマウスの骨芽細胞、軟骨細胞および肢芽細胞を用いて、分子生物学的解析を行う基盤が構築できた。２．Zfhx3シングルノックアウトマウスを用いて、Zfhx3の骨格形成における解析を行った。その結果、Zfhx3ノックアウトでは、明確な骨格形成異常を認めなかった。この解析結果より、骨格形成におけるZfhx3の機能は、Zfhx4により代償されいると推測された。そこで、Zfhx3およびZfhx4ダブルノックアウトマウスを作製したが、早期致死を来たしているようため、その解析は困難であった。この点を解消するために、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いて、Zfhx3 floxマウスの作製に取り掛かった。令和４年度までに、Zfhx3の遺伝子座に一箇所のloxP配列を挿入したマウスの作製を行った。ゲノムDNAを用いたPCRおよびDNAシークエンス解析により、loxP配列の挿入を確認できた。引き続き、Zfhx3遺伝子座のもう一箇所にloxP配列を挿入して、Zfhx3コンディショナルノックアウトマウスの作製を進め、最終的にはZfhx3およびZfhx4コンディショナルノックアウトマウスの作製ならびに解析を行う体制が整った。

1.为了分析 Zfhx3 和 Zfhx4 的靶基因，我们收集了 Flag 标记的 Zfhx4 敲入小鼠的细胞，使用抗 Flag 抗体检查并优化了染色质免疫沉淀的条件。此外，为了分析染色质结构，我们开发了一种使用Cut&Run方法的分析方法，据称该方法比传统的ATAC-seq分析更灵敏。这些研究结果为利用Flag-Zfhx4敲入小鼠的成骨细胞、软骨细胞和肢芽进行分子生物学分析奠定了基础。 2.使用 Zfhx3 单敲除小鼠，我们分析了 Zfhx3 在骨骼形成中的作用。结果，在 Zfhx3 敲除中没有观察到明显的骨骼发育不良。根据该分析的结果，推断Zfhx3在骨架形成中的功能被Zfhx4补偿。因此，我们生成了 Zfhx3 和 Zfhx4 双敲除小鼠，但对它们的分析很困难，因为它们似乎过早致死。为了解决这个问题，我们开始使用 CRISPR/Cas9 系统进行基因组编辑来创建 Zfhx3 flox 小鼠。到 2020 年，我们培育出了一只小鼠，其中单个 loxP 序列被插入到 Zfhx3 基因位点中。通过 PCR 和使用基因组 DNA 的 DNA 序列分析证实了 loxP 序列的插入。随后，将loxP序列插入Zfhx3基因位点的另一个位置，生成Zfhx3条件敲除小鼠，最后建立系统来生成和分析Zfhx3和Zfhx4条件敲除小鼠。

项目成果

Cell-to-Cell Communication; Cell Atlas; Visual Biology in Oral Medicine

细胞间通讯；

• 发表时间: 2022
• 作者: Hata K;Ono K;Nakamura E;Kobayashi S;Takahata Y;Murakami T;Nishimura R;花島律子，松本英之，出江紳一，宇川義一，緒方勝也，金子文成，鬼頭伸輔，小林正人，寺尾安生，中村元昭，西田圭一郎，野田賀大，細身晃一;Nishimura R;Riko Nishimura and Hendrik Terheyden
• 通讯作者: Riko Nishimura and Hendrik Terheyden

Dmrt2 promotes transition of endochondral ossification by linking Sox9 and Runx2

Dmrt2通过连接Sox9和Runx2促进软骨内骨化转变

• 发表时间: 2021
• 作者: Hata K;Ono K;Nakamura E;Kobayashi S;Takahata Y;Murakami T;Nishimura R
• 通讯作者: Nishimura R

The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.

• DOI: 10.1371/journal.pgen.1009765
• 发表时间: 2022-07
• 期刊: PLoS genetics
• 影响因子: 4.5

Transcriptional regulation of FRZB in chondrocytes by Osterix and Msx2

• DOI: 10.1007/s00774-022-01345-3
• 发表时间: 2022-06-28
• 期刊: JOURNAL OF BONE AND MINERAL METABOLISM
• 影响因子: 3.3
• 作者: Yagi，Hiroko;Takahata，Yoshifumi;Nishimura，Riko
• 通讯作者: Nishimura，Riko

Identification of Chondrocyte-specific Sox9 Enhancers Important for Skeletal Development

鉴定对骨骼发育重要的软骨细胞特异性 Sox9 增强剂

• 发表时间: 2021
• 作者: Kobayashi S;Hata K;Takahata Y;Murakami T;Uzawa N;Nishimura R.
• 通讯作者: Nishimura R.