初期分泌経路における亜鉛恒常性維持とタンパク質恒常性維持の相関と分子構造基盤

早期分泌途径中锌稳态和蛋白质稳态的相关性和分子基础

基本信息

批准号：
21H04758
负责人：
稲葉謙次
金额：
$ 27.12万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2022年度は、ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体ZnT4/5/6/7を介した亜鉛恒常性維持機構と、亜鉛依存性分子シャペロンERp44を介したタンパク質恒常性維持機構に関する詰めの研究を行い、論文がNature Communications誌に受理されるに至った。一方これまで、小胞体からサイトゾルに亜鉛を排出する膜輸送体ZIP7の生理機能については十分に理解されていなかったため、ZIP7ノックダウンおよび阻害剤処理の実験を系統的に行った。その結果、ZIP7阻害処理に伴う小胞体内の亜鉛濃度の上昇を観測し、さらにそのことに起因して、ERp44の細胞内局在、トラフィック、およびクライアント滞留活性の変化を観測した。最終的に、小胞体の亜鉛恒常性維持とレドックス恒常性維持が密接に関わっていることを突き止め、現在論文作成に取りかかるところである。ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体ZnT7のクライオ電顕による構造解析も大きく進展し、亜鉛結合状態および非結合状態の両方について、原子分解能に近いレベルで構造を決定することに成功した。興味深いことに、この構造解析により、ZnT7に特徴的な長いヒスチジンループがサイトゾル側で亜鉛イオンをリクルートする様子を捉えることに成功し、ZnT7による亜鉛輸送機構に関する重要な情報が得られ、現在リバイス原稿投稿準備中である。また小胞体の亜鉛輸送体ZIP7についても、大量発現精製系を構築し、それに特異的に結合するナノボディの作製にも成功した。クライオ電顕によるZIP7の構造解析の下地はおよそ出来たと考えている。

2022年，我们将对高尔基体中锌转运蛋白ZnT4/5/6/7介导的锌稳态维持机制和锌依赖性分子伴侣ERp44介导的蛋白质稳态维持机制进行综合研究。该论文已被 Nature Communications 接收。另一方面，由于ZIP7（一种将锌从内质网分泌到细胞质的膜转运蛋白）的生理功能尚未完全了解，因此我们进行了ZIP7敲低和抑制剂治疗的系统实验。结果，我们观察到由于 ZIP7 抑制处理，内质网中的锌浓度增加，并且我们还观察到由此导致的 ERp44 的细胞内定位、运输和客户保留活性的变化。最终，我们发现内质网锌稳态的维持与氧化还原稳态的维持密切相关，目前正在撰写论文。利用冷冻电子显微镜对高尔基体中锌转运蛋白ZnT7的结构分析也取得了很大进展，我们成功地在接近原子分辨率的水平上确定了锌结合态和非锌结合态的结构。。有趣的是，该结构分析成功地捕获了 ZnT7 的长组氨酸环特征如何在胞质侧招募锌离子，提供了有关 ZnT7 锌转运机制的重要信息，目前正在修订手稿，目前正在准备提交。我们还构建了内质网锌转运蛋白ZIP7的大规模表达和纯化系统，并成功构建了与其特异性结合的纳米抗体。我们相信使用冷冻电镜对 ZIP7 进行结构分析的基础已经准备好。