細胞外基質による細胞機能制御機構の包括的理解とその応用基盤の研究

细胞外基质调控细胞功能机制的全面认识及其应用基础研究

基本信息

批准号：
21H04713
负责人：
木岡紀幸
金额：
$ 26.87万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

多細胞生物(動物)では、細胞外環境(細胞周囲に存在するコラーゲン等の細胞外基質など)が細胞の機能や分化を調節する。特に細胞外基質の「硬化」は間葉系幹細胞の分化方向性を変化させ、また、がんの悪性化を引き起こす。このため、多細胞生物の根幹の理解と疾患の新たな予防法の開発には、細胞外基質の硬さを感知する仕組みの解明が必須である。本研究では、細胞外基質の硬さによる細胞機能制御機構を包括的に理解するために、a) 接着班プロテオームを起点とした新規鍵分子の同定、b)接着斑細胞膜脂質の組成分析からの解析、c)ビンキュリン-SORBS1/3の構造生物学的解析、d)硬さ感知モジュレーター系の構築の4つのアプローチから研究を進めている。本年度は、センサー分子の有無の状態の細胞を硬い基板であるシャーレ上で培養し、その後接着斑を単離した。これをプロテオーム解析することで、接着斑への濃縮が変化するタンパク質候補の同定を試みた。プロテオーム解析により得られた候補タンパク質からいくつかの基準で候補タンパク質を絞り込み、それらの候補タンパク質のsiRNAを間葉系幹細胞に導入し、硬さにより発現が変動するYAPの応答遺伝子の発現が硬い培養基板であるシャーレ上で上がる、あるいは、下がる、を指標にさらなる絞り込みを行った。またビンキュリンの活性型とSORBS1またはSORBS3の立体構造の解析を目指し、これらタンパク質を動物培養細胞で発現させ、高純度に精製できる条件の検討を行った。

在多细胞生物（动物）中，细胞外环境（细胞外基质，例如存在于细胞周围的胶原蛋白）调节细胞功能和分化。特别是细胞外基质的“硬化”会改变间充质干细胞的分化方向，导致癌症恶变。因此，阐明感知细胞外基质硬度的机制对于理解多细胞生物的基本原理和开发预防疾病的新方法至关重要。在本研究中，为了全面了解细胞外基质硬度调节细胞功能的机制，我们的目标是a）基于粘附斑蛋白质组识别新的关键分子，b）分析粘附斑细胞膜脂质的组成。正在使用四种方法进行研究：c) vinculin-SORBS1/3 的结构生物学分析，以及 d) 硬度传感调节器系统的构建。今年，我们在硬质基质（培养皿）上培养带有和不带有传感器分子的细胞，然后分离粘着斑。通过对此进行蛋白质组学分析，我们试图鉴定粘着斑浓度发生变化的候选蛋白质。根据通过蛋白质组分析获得的候选蛋白质中的几个标准来缩小候选蛋白质的范围，并将这些候选蛋白质的siRNA导入间充质干细胞中，并培养表达量随硬度而变化的YAP响应基因的表达。根据它在作为基质的培养皿上是否上升或下降，进一步缩小了搜索范围。此外，为了分析纽蛋白活性形式和SORBS1或SORBS3的三维结构，我们在培养的动物细胞中表达这些蛋白质，并检查了它们可以纯化到高纯度的条件。