Mechanism of Peptide Amidation: Structural and Kinetic Studies

肽酰胺化机制:结构和动力学研究

基本信息

  • 批准号:
    0920288
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 115.64万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
    Continuing Grant
  • 财政年份:
    2009
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2009-08-01 至 2015-07-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Intellectual Merit: Amidated peptides are part of signaling systems in species ranging from Aplysia to humans. In all cases, glycine-extended intermediates are transformed into active amidated hormones by oxidative cleavage of the glycine N-C(alpha) bond by a bifunctional enzyme, peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase (PAM). The PAM gene encodes two domains that catalyze the two sequential reactions producing amidated peptide; alpha-hydroxylation of the glycine (PHM) and excision of the C(alpha)-N bond to give the alpha-amidated peptide plus glyoxylate (PAL). PHM contains two redox active copper atoms that, after reduction by ascorbate, catalyze the reduction of molecular oxygen for hydroxylation of glycine-extended substrates. PAL is a zinc-containing lyase that cleaves the C(alpha)-N bond after hydroxylation. As part of previous work, the structures of reduced and oxidized PHM, alone and with substrates, were determined. Structural and kinetic characterization of small molecule ligands of PHM as well as selected mutants were also accomplished. In a very important development, the determination of the structure of the catalytic core of PAL was accomplished. This led to the determination of the structure of PAL in complex with a non-peptidic substrate (hyrdoxyhippuric acid), proposing a mechanism, and the design and validation of a PAL inhibitor. In addition, kinetic studies of selected mutants were carried out to confirm the mechanism. This project involves further characterization of the PHM copper centers using single crystal and solution XAFS, and identification of the species that abstracts the substrate hydrogen in PHM. Studies on PAL are centered on addressing additional features of its mechanism by studying mutants, the effects of reductants, and the kinetics of a new inhibitor. The structure of PAM will be determined as a complete construct containing the PHM and PAL domains and as a complex of the two domains. The interaction between the two domains will be characterized using solution methods. The project will also explore whether the two-step reaction takes place with release of the PHM product or if it occurs processively by an internal transfer from PHM to PAL. The studies will advance understanding of peptide amidation which is a fundamental step in signal transduction. They will, in addition, provide an outstanding paradigm for understanding long range electron transfers as well as processivity in two step enzymes. Moreover, PHM is homologous in sequence and mechanism to dopamine beta-monooxygenase -the enzyme that converts dopamine to norepinephrine, a key neurotransmitter. Broader Impact The PI is actively involved in bringing the excitement of science to high school students, undergraduates and underrepresented minorities. He teaches classes in two undergraduate courses, and has collaborations with two laboratories at undergraduate teaching institutions. He participated in a broad range of outreach activities that have been directed at members of underrepresented groups. The laboratory of the PI participates annually in the Department-wide Science Day organized in conjunction with the Baltimore City school system for students from the inner city. The PI has a strong presence in the Hispanic scientific community and in Latin American science. He is a founding member and past president of the Society for Latin American Biophysicists (SOBLA). The PI currently trains four minority students in his laboratory.
智力优点:酰胺化肽是从海兔到人类等物种信号系统的一部分。在所有情况下,甘氨酸延伸的中间体通过双功能酶肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)氧化裂解甘氨酸N-C(α)键而转化为活性酰胺化激素。 PAM 基因编码两个结构域,可催化产生酰胺化肽的两个连续反应;甘氨酸 (PHM) 的 α-羟基化和 C(α)-N 键的切除得到 α-酰胺化肽加乙醛酸 (PAL)。 PHM 含有两个氧化还原活性铜原子,在被抗坏血酸还原后,催化分子氧还原,以实现甘氨酸延伸底物的羟基化。 PAL 是一种含锌裂解酶,可在羟基化后裂解 C(α)-N 键。作为先前工作的一部分,确定了单独和与底物一起还原和氧化的 PHM 的结构。还完成了 PHM 小分子配体以及选定突变体的结构和动力学表征。一项非常重要的进展是确定了 PAL 催化核心的结构。这导致确定了 PAL 与非肽底物(羟基马尿酸)复合物的结构,提出了一种机制,并设计和验证了 PAL 抑制剂。此外,还对选定的突变体进行了动力学研究以证实其机制。该项目涉及使用单晶和溶液 XAFS 进一步表征 PHM 铜中心,以及鉴定在 PHM 中提取底物氢的物质。 PAL 研究的重点是通过研究突变体、还原剂的作用和新抑制剂的动力学来解决其机制的其他特征。 PAM 的结构将被确定为包含 PHM 和 PAL 结构域的完整构建体以及这两个结构域的复合体。两个域之间的相互作用将使用求解方法来表征。该项目还将探讨两步反应是否随着 PHM 产品的释放而发生,或者是否通过从 PHM 到 PAL 的内部转移逐步发生。这些研究将增进对肽酰胺化的理解,肽酰胺化是信号转导的基本步骤。此外,它们还将为理解长程电子转移以及两步酶的持续合成能力提供一个杰出的范例。此外,PHM 在序列和机制上与多巴胺 β-单加氧酶(将多巴胺转化为去甲肾上腺素(一种关键的神经递质)的酶)同源。更广泛的影响 PI 积极致力于将科学的乐趣带给高中生、本科生和代表性不足的少数族裔。他教授两门本科课程,并与本科教学机构的两个实验室有合作。他参加了一系列针对代表性不足群体成员的外展活动。 PI 实验室每年都会参加与巴尔的摩市学校系统联合为内城学生举办的全系科学日活动。 PI 在西班牙科学界和拉丁美洲科学界拥有强大的影响力。他是拉丁美洲生物物理学家协会 (SOBLA) 的创始成员和前任主席。该 PI 目前在他的实验室培训四名少数民族学生。

项目成果

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  • 作者:
    下川千寿;城田(原田)沙織;佐藤秀明;杉島正一;原田二朗;東元祐一郎;L. Mario Amzel;野口正人
  • 通讯作者:
    野口正人
ヒト由来ペプチドC末端アミド化酵素の結晶構造解析を目指して
旨在分析人源肽C末端酰胺化酶的晶体结构
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  • 通讯作者:
    野口正人

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